Metal multifuncional

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2688 (2022) Citar este artículo

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La respuesta inmune inhibida y los bajos niveles de administración restringen la eficacia de la terapia contra el cáncer por inanición. Aquí, informamos sobre la administración conjunta de glucosa oxidasa (GOx) y el inhibidor de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), 1-metiltriptófano, utilizando un nanorreactor basado en una estructura organometálica (MOF), que muestra una liberación amplificada para la inanición del tumor. inmunoterapia de oxidación. El nanosistema supera significativamente las biobarreras asociadas con la penetración del tumor y mejora la biodisponibilidad de la carga debido a la estrategia de inversión de carga y reducción de tamaño activada por el microambiente tumoral débilmente ácido. El nanosistema se desmonta y libera rápidamente cargas en respuesta a las especies reactivas de oxígeno intracelular (ROS). GOx consume glucosa de manera competitiva y genera ROS, lo que induce aún más el desmontaje del MOF autoamplificable y la liberación del fármaco. La inmunoterapia combinada de inanición/oxidación con bloqueo de IDO no solo fortalece la respuesta inmune y estimula la memoria inmune a través de la inanición tumoral activada por GOx y el reclutamiento de células T efectoras, sino que también alivia eficazmente la tolerancia inmune mediante el bloqueo de IDO, inhibiendo notablemente el crecimiento del tumor. y metástasis in vivo.

La terapia de inanición representada por la glucosa oxidasa (GOx) ha sido reconocida como una estrategia “verde” contra el cáncer, ya que corta el suministro de nutrientes necesario a los tumores con efectos secundarios insignificantes1. GOx se ha aplicado para la terapia de inanición contra el cáncer, debido a su capacidad para exhibir efectos inmunoestimulantes2,3,4. Puede matar tumores de manera efectiva al agotar la glucosa de manera emulativa y generar especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas, facilitando así la exposición de antígenos asociados a tumores (TAA) para un efecto antitumoral general5. Sin embargo, su efecto inmunoestimulador se inhibe naturalmente debido a varios mecanismos de resistencia inmune de retroalimentación negativa6. El bloqueo de las vías reguladoras negativas combinado con la terapia de inanición/oxidación representa una de las estrategias más prometedoras para la inmunoterapia tumoral7.

La proteína del punto de control inmunológico indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) se expresa altamente en tumores, lo que puede inhibir la proliferación de células T efectoras e inducir la expansión de las células T reguladoras (Treg) al catalizar triptófano (Trp) a quinurenina (Kyn). , presentándose así como un objetivo inmunoterapéutico atractivo para aliviar el microambiente inmunosupresor8,9. Los estudios recientes sugirieron que el inhibidor competitivo específico de IDO, es decir, 1-metiltriptófano (1-MT), podría aliviar eficazmente la evasión inmune10,11,12. Sin embargo, se demostró una inmunidad anticancerígena modesta para la monoterapia con bloqueo de IDO debido a una presentación de antígeno y una respuesta inmune insuficientes13. Por lo tanto, la combinación de la inmunoterapia de bloqueo IDO mediada por 1-MT y la inanición/oxidación activada por GOx puede ser una estrategia factible contra tumores con una fuerte respuesta inmune y una resistencia inmune débil.

Como la escasa biodisponibilidad y la rápida inactivación de GOx y las barreras biológicas secuenciales dan como resultado una penetración tumoral limitada y una endocitosis baja, la construcción de nanosistemas multifuncionales para la transferencia eficiente de GOx y 1-MT en tumores es crucial para mejorar la eficacia de la terapia14,15. Por un lado, los nanorreactores basados ​​en estructura metal-orgánica (MOF) que combinan las ventajas de los MOF (p. ej., alta capacidad de carga y buena fidelidad enzimática) y los nanorreactores (p. ej., espacio de reacción restringido para enzimas) se han propuesto como vehículos ideales16,17 , debido a la coadministración eficiente de enzimas biológicas no tóxicas (p. ej., GOx) y 1-MT a los tumores. Por lo tanto, la liberación de carga in situ y la catálisis del sustrato (p. ej., glucosa) conducen a la generación de especies tóxicas (p. ej., H2O2) con biodisponibilidad y eficacia terapéutica mejoradas. Por otro lado, la estrategia cambiable de tamaño/carga activada por el microambiente tumoral puede superar estas barreras biológicas, lo que conduce a una mejor eficiencia de administración y efecto terapéutico18,19. Por lo tanto, los nanorreactores basados ​​en MOF con características de cambio de tamaño/carga representan un nanosistema apropiado para estimular la respuesta inmune antitumoral a través de la inmunoterapia combinada de bloqueo IDO-inanición/oxidación.

En este trabajo, se ha construido un nanosistema basado en nanorreactor MOF degradable de doble sensibilidad pH/ROS (denominado PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT) con liberación de fármaco autoamplificada y penetración tumoral mejorada para coadministrar GOx. y 1-MT para la inmunoterapia de inanición/oxidación/bloqueo de IDO. En comparación con estudios anteriores, el presente nanosistema presenta las siguientes cuatro ventajas importantes (Fig. 1): (1) El nanorreactor MOF degradable activado por tumores se sintetiza mediante la reticulación covalente con los agentes susceptibles a ROS y Mn2+, que se pueden desmontar rápidamente y activarse. por las ricas ROS intracelulares de las células tumorales, minimizando así la toxicidad de retención a largo plazo de los MOF convencionales; (2) La estrategia cambiable de tamaño/carga diseñada en el nanorreactor rompe secuencialmente las biobarreras y mejora la eficiencia de entrega. La cubierta protectora del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT exhibe una rápida eliminación del componente de polietilenglicol (PEG) para producir un núcleo catiónico conjugado con polietilenimina (PEI) en respuesta al microambiente tumoral débilmente ácido (pH~ 6.8). El nanosistema transformado con carga fuertemente positiva y tamaño pequeño mejora significativamente la profundidad de penetración del tumor y la endocitosis; (3) El consumo de glucosa por parte de GOx va acompañado de una generación elevada de H2O2, que puede convertirse aún más en radical hidroxilo (·OH) con alta toxicidad a través de una reacción tipo Fenton mediada por Mn2+, lo que conduce a la degradación completa del MOF. liberación de fármacos y eficacia terapéutica mejorada; (4) Aprovechando la respuesta inmune promovida por la terapia de inanición/oxidación mediada por GOx y la supresión de la resistencia inmune ejecutada por la inmunoterapia de bloqueo IDO, el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT presenta un efecto terapéutico notable. Por lo tanto, la construcción exitosa del nanorreactor multifuncional PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT proporciona un paradigma para superar eficazmente las biobarreras de administración y revelar una eficacia superior en la eliminación de tumores mediante la terapia de inanición junto con efectos inmunomoduladores.

Ruta sintética e ilustración esquemática del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT para combinación de inanición, oxidación e inmunoterapia.

Para construir MOF basado en Mn (Mn-DTA) sensible a ROS, se sintetizó un compuesto 1 (enlazador) sensible a ROS (consulte la sección de Métodos y detalles experimentales complementarios), que se confirmó mediante 1H NMR y espectrometría de masas (Fig. 2a, b). Posteriormente se sintetizó Mn-DTA mediante la reacción hidrotermal. Los fuertes picos de difracción para los planos de 100 °, 002 °, 101 °, 102 °, 110 °, 103 ° y 112 ° se observan en el patrón de difracción de rayos X en polvo (DRX) (Fig. 2c), de acuerdo con la estructura cristalina. de MnS20,21. Además, los resultados calculados basados ​​en la base de datos CCDC demostraron que Mn2+ en realidad se coordina con tres ligandos del compuesto 1 para formar una estructura de prisma hexagonal regular (Fig. 2d-f). En particular, tres iones Mn2+ ocupan los tres vértices del hexágono, y dos iones Mn2+ se ubican en los dos vértices del cuadrilátero en cada prisma hexagonal, mientras que el conector entre Mn2+ y –COOH del compuesto 1 forma los lados del prisma hexagonal. Mientras tanto, cada Mn2+ es compartido por dos cuadriláteros adyacentes y un hexágono (Fig. 2g). Estos resultados revelaron colectivamente que Mn-DTA poseía una estructura de red porosa tridimensional20.

a 1H NMR y (b) espectros ESI-MS del compuesto 1. c Patrón XRD en polvo de Mn-DTA (MnS, JCPDS No, 89-4089). d Estructura de la célula unitaria y (e, f) estructura cristalina (3 × 3 x 3) de MnS calculada por la base de datos CCDC (entrada ICSD: 44765). g Diagrama esquemático de la morfología cristalina de Mn-DTA-MOF. Las uniones violetas y amarillas representan átomos de Mn y S, respectivamente.

La estructura morfológica de Mn-DTA se detectó mediante microscopía electrónica de transmisión/barrido (TEM/SEM). Como se muestra en la Fig. 3a y en la Fig. 1a complementaria, Mn-DTA exhibe una estructura esférica con un tamaño de ~ 50 nm, lo que es beneficioso para superar las biobarreras de alta presión intersticial y matriz extracelular tumoral densa, lo que conduce a una penetración tumoral superior y una eficiencia de entrega mejorada22,23. La estructura de Mn-DTA se verificó aún más mediante mapeos elementales de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) de Mn, S y O (Fig. 3b), que se originan a partir de MnCl2 y el compuesto 1. En particular, Mn-DTA exhibe los espacios de red. de 0,305 y 0,328 nm detectados por HRTEM (Figura complementaria 1b), que son consistentes con los valores para los planos (101, 002) de MnS determinados por XRD. El análisis Brunauer-Emmett-Teller (BET) de Mn-DTA reveló una isoterma típica de tipo IV (Figura complementaria 2), lo que implica una estructura mesoporosa distinta. Además, el área de superficie, el tamaño promedio de los poros de adsorción y el potencial zeta de Mn-DTA fueron 107,8 m2 g-1, 8,61 nm y −54 mV (Figura 3 complementaria y Tabla 1 complementaria), respectivamente. Los resultados confirmaron que se sintetizó con éxito el núcleo de Mn-DTA con un tamaño adecuado.

una imagen TEM y (b) mapeos de elementos EDS de Mn-DTA. c Imagen TEM de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. d Curvas DLS de Mn-DTA y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT después del tratamiento respectivo a pH 7,4 o 6,8 con o sin H2O2 durante 4 h. e Espectros de absorbancia de GOx, 1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT incubados con diversas concentraciones de H2O2 o glucosa durante 12 h. f, g Imágenes TEM de Mn-DTA (f) y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (g) tratadas con H2O2 durante 4 h. Barras de escala: 50 nm para a, b y f, 100 nm para cy g.

Posteriormente, se construyó PCP-Mn-DTA conjugando el compuesto 3 como la cubierta en la superficie del núcleo de Mn-DTA. El compuesto 3 se sintetizó con éxito como se informó anteriormente 19 y se confirmó mediante espectroscopia de RMN 1H, cromatografía de permeación en gel (GPC) y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Figuras complementarias 4, 5 y Tabla complementaria 2). Después de la funcionalización con el caparazón y la carga conjunta con GOx y 1-MT, el PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT obtenido mostró una morfología similar a la del núcleo Mn-DTA. Sin embargo, existía una capa externa obvia alrededor de Mn-DTA, y la estructura general de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se volvió borrosa (Fig. 3c). Además, el diámetro aumentó de 49,5 ± 7,3 a 97,0 ± 4,5 nm (n = 300), como lo confirma la dispersión dinámica de la luz (DLS, Fig. 3d). Además, el potencial de superficie aumentó de −54 mV a −13,7 mV (Figura complementaria 3). En particular, el espectro de absorción de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mostró los picos característicos de GOx y 1-MT (Fig. 3e), lo que sugiere una carga exitosa del fármaco. Los contenidos de carga de GOx y 1-MT fueron del 8,8% y el 13,5%, respectivamente (Figura complementaria 6). Además, el nanosistema exhibió una bioestabilidad efectiva, como lo indica la retención de tamaño tras la incubación con suero al 10% durante 6 días (Figura 7 complementaria), lo que favorece la administración de fármacos in vivo.

Las características vitales del nanosistema PCP-Mn-DTA fueron la reducción de tamaño sensible al pH, la conversión de carga, la degradación autoamplificada activada por ROS y la liberación de carga, que se desean para mejorar la penetración del tumor y la absorción celular24, lograr la liberación completa del fármaco, suministrar ROS para la destrucción de tumores, etc. La inversión de carga sensible al pH y la reducción de tamaño del nanosistema se caracterizaron por TEM, DLS y potencial zeta. Después de la incubación con pH 6,8 (simulando el microambiente tumoral), el tamaño promedio de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT disminuyó drásticamente a alrededor de 55 nm (Fig. 3d), que estaba cerca del tamaño del Mn-DTA nativo. , debido a la eliminación de la cubierta de PEG19. Mientras tanto, el potencial de superficie se invirtió en consecuencia de −13,7 mV a +34,2 mV (Figura complementaria 3), confirmando así la inversión de carga sensible al pH.

El desmontaje autoamplificado sensible a ROS y el comportamiento de liberación de fármacos del nanosistema se verificaron mediante espectroscopía TEM, DLS y UV-vis. Como se demuestra en la Fig. 3f, g, la estructura esférica natural de Mn-DTA y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT colapsó tras la exposición al H2O2, lo que fue consistente con DLS (Fig. 3d), lo que implica que ROS -desmontaje sensible. Además, los espectros UV-vis de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT revelaron que la intensidad máxima característica de GOx y 1-MT mejoró al aumentar la concentración de H2O2 (Fig. 3e), lo que indica la respuesta a ROS. liberación de drogas. En particular, después de la exposición a la glucosa, la intensidad máxima de absorción de GOx y 1-MT en el nanosistema aumentó considerablemente, debido a la autogeneración de ROS catalizada por GOx y la liberación autoamplificada del fármaco.

Para demostrar aún más el comportamiento de liberación del fármaco sensible a ROS, se realizó simultáneamente el ensayo de liberación en tiempo real. Se observó una liberación insignificante de GOx (por debajo del 16%) en el grupo de control en condiciones fisiológicas (pH 7,4) durante 24 h (Fig. 4a), lo que sugiere una buena estabilidad del nanosistema. Por el contrario, aproximadamente el 58% y el 79% de GOx se liberaron de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT tras la incubación con H2O2 0,1 y 1 mM respectivamente, lo que confirma la liberación del fármaco sensible a ROS. Después de la interacción con la glucosa, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mostró una alta liberación de GOx (~81% y 90%), debido a la autogeneración de ROS y la liberación de fármaco amplificada en cascada desencadenada por GOx. Vale la pena señalar que PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT exhibió una liberación suficiente del fármaco cuando se expuso a la glucosa biológicamente relevante y a la concentración intratumoral de ROS (0,1 mM H2O2, Fig. 4a)25. Esta característica puede potencialmente superar la limitación de liberación incompleta del fármaco causada por la concentración insuficiente de ROS endógeno, mejorando así la eficiencia de destrucción de tumores.

a Liberación acumulativa de GOx de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT después de tratamientos con diferentes concentraciones de H2O2 o H2O2 más glucosa (abreviada como Glu). b, c valores de pH y concentraciones de H2O2 generadas en varios puntos de tiempo surgidos de GOx (b) y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (c) reacción de desintegración catalizada de la glucosa. d Imágenes CLSM y (e) mediciones cuantitativas de ROS intracelular. Los datos representan la media ± DE (n = 4 muestras independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01. Barra de escala: 50 μm.

Para revelar la actividad catalítica de GOx y la capacidad de autogeneración de ROS del nanosistema, se emplearon la prueba de actividad enzimática y la microscopía de barrido láser confocal basada en sonda ROS (CLSM)26. Normalmente, se incubaron GOx y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT libres con glucosa para evaluar la actividad de GOx, que se reflejó en el cambio de pH (inducido por ácido glucónico) y la generación de H2O2. Como se muestra en la Fig. 4b, c, los valores de pH disminuyeron gradualmente y la generación de H2O2 aumentó, junto con la duración de la reacción catalítica, tanto en los grupos GOx como en PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. La reducción del pH y la generación de H2O2 en PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT alcanzó rápidamente el equilibrio en 1 h, y también se observó una tendencia similar en GOx libre. Estos resultados confirmaron una alta actividad catalítica del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, que no se vio afectada por la encapsulación de MOF. En comparación con los grupos control y PCP-Mn-DTA negativo, tanto los grupos PCP-Mn-DTA@GOx como PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT generaron efectivamente ROS, como lo revela la fluorescencia verde y el análisis cuantitativo relacionado (Fig. 4d, e). La cantidad de generación de ROS por PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT disminuyó drásticamente en ausencia de glucosa (p <0,01). Los resultados confirmaron que el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podía lograr una liberación eficiente del fármaco y que las ROS generadas por el nanosistema dependían de la glucosa.

El ensayo CCK8 se empleó para evaluar la citotoxicidad in vitro del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT contra células B16F10. En comparación con el control, PCP-Mn-DTA mostró una citotoxicidad insignificante con dosis (50–1000 μg mL-1) independientemente del tiempo de incubación (Figura 8 complementaria), lo que sugiere una compatibilidad óptima del nanoportador PCP-Mn-DTA. Además, la 1-MT libre causó daño celular específico (Fig. 5a), debido a su débil toxicidad27. Mientras tanto, se mostró una viabilidad celular relativamente baja para PCP-Mn-DTA@1-MT en comparación con la 1-MT libre, inducida por la excelente eficiencia de administración del fármaco. Después de cargar con GOx, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT provocó un daño celular más severo, atribuido al daño por inanición/oxidación inducido por GOx28,29. Además, la viabilidad celular más baja se produjo en PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT más glucosa después de 48 h después de la incubación. Los resultados indicaron que el nanosistema eliminó efectivamente las células tumorales mediante la generación de ROS catalizada por GOx (Fig. 4d, e), y la adición de glucosa promovió aún más la muerte de las células B16F10 mediante la catálisis de GOx.

a Estudios de citotoxicidad de células B16F10 cultivadas con PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT con o sin glucosa durante 24 h y 48 h , respectivamente. b Imágenes de penetración tumoral y (c) endocitosis de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT marcadas con FITC en B16F10 MCS después de la incubación respectiva a pH 6,8 o 7,4 durante 4 h y 12 h, con imágenes representativas de 3 experimentos. Los núcleos y el citoesqueleto se tiñeron respectivamente con DAPI (azul) y ActinRed™555 (rojo). d Análisis cuantitativo de FCM basado en (c). Los datos representan la media ± DE (n = 6 muestras biológicamente independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01. Barras de escala: 100 µm para b, 50 µm para c.

Los esferoides multicelulares (MCS) basados ​​en células B16F10 se construyeron para evaluar la propiedad de infiltración tumoral del nanosistema19. Para ello, se marcaron GOx y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y se utilizó CLSM para controlar la penetración del nanosistema. Como se muestra en la Fig. 5b, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se dispersó alrededor del límite exterior de los MCS a pH 7,4 después de 4 h después de la incubación, y solo una pequeña fracción de PCP-Mn-DTA@GOx@ 1-MT entró dentro de los MCS después de 12 h de incubación, lo que indica la penetración restringida de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT debido a su tamaño relativamente grande. Curiosamente, la fluorescencia verde emitida por PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se distribuyó ampliamente en todos los MCS después de la incubación a pH 6,8 durante 4 h, lo que sugiere una buena penetración del tumor. Además, la tendencia a la penetración aumentó aún más a medida que la duración de la incubación se prolongó a 12 h, como lo revela una fluorescencia verde mucho más fuerte. El análisis cuantitativo confirmó la penetración tumoral mejorada por el pH del nanosistema (Figura complementaria 9), debido a la reducción de tamaño y la conversión de carga en respuesta al microambiente tumoral débilmente ácido. Los resultados demostraron colectivamente que el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT poseía una capacidad de penetración tumoral favorable, lo que es útil para superar las biobarreras y mejorar la eficiencia de la administración de fármacos.

Posteriormente se investigó el nivel de absorción celular del nanosistema en las células B16F10 mediante citometría de flujo (FCM) y CLSM. En comparación con el control, la absorción de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT por las células B16F10 mostró un comportamiento dependiente del tiempo, y la cantidad de endocitosis de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT fue notablemente mayor. que GOx libre a pH 7,4 o pH 6,8 (Fig. 5c, d), lo que indica nuevamente el efecto de entrega superior del nanoportador PCP-Mn-DTA. Además, la población endocitosada a pH 6,8 era mucho mayor que la de pH 7,4, independientemente del tiempo de incubación. Este fenómeno se debe al hecho de que la transformación de tamaño y carga del nanosistema a un pH bajo aumenta la eficiencia de la endocitosis. Estos resultados indicaron que la reducción de tamaño y la conversión de carga del nanosistema activado por el microambiente tumoral débilmente ácido podrían mejorar significativamente la infiltración del tumor y la captación celular, lo que es útil para matar tumores30,31.

Para estudiar el efecto inhibidor del nanosistema sobre la actividad de la enzima IDO in vitro, se midió mediante transferencia Western la expresión de IDO en las células B16F10 tratadas con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. En comparación con los grupos negativos de control (PBS) y PCP-Mn-DTA, 1-MT mostró una inhibición obvia de la expresión de IDO (Fig. 6a)32. Además, tanto PCP-Mn-DTA@1-MT como PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT inhibieron la regulación negativa de la expresión de IDO de manera más significativa en comparación con 1-MT libre (p <0,01, Fig. 6b), lo que sugiere que la supresión de la actividad IDO se vio beneficiada por la eficiencia de entrega avanzada del nanosistema10.

a, b Efecto de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT sobre la expresión de IDO después del tratamiento detectado por Western blot (a) y análisis cuantitativo (b). c Resultados de FCM y (d) análisis cuantitativo de la proporción de células T EdU+ cocultivadas con células B16F10 después de los tratamientos con PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA @GOx@1-MT, respectivamente. e Representación esquemática del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT sobre el mecanismo de inhibición de IDO1 en células tumorales. Los datos se muestran como media ± DE y son representativos de 4 (a, b) o 6 (c, d) experimentos independientes. Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01.

Para revelar el efecto de inhibición de IDO mediado por el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT sobre la proliferación de células T, se construyó un modelo de cocultivo in vitro compuesto por células B16F10 y linfocitos para examinar la proliferación33. Como se muestra en la Fig. 6c, en comparación con el control (PBS), la proporción de células T EdU+ aumentó significativamente después del tratamiento con formulaciones cargadas de 1-MT y 1-MT (PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP- Mn-DTA@GOx@1-MT), lo que implica una proliferación mejorada de células T. Además, la cantidad de células T proliferadas en PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT fue mayor que la del grupo 1-MT (Fig. 6d), lo que reconfirma la excelente eficiencia de entrega del nanosistema. El fenómeno se puede explicar de la siguiente manera (Fig. 6e): primero, la eficiencia de absorción y la biodisponibilidad de 1-MT libre están limitadas por su escasa solubilidad. Por el contrario, el PCP-Mn-DTA con una alta capacidad de carga del fármaco puede superar eficazmente la escasa solubilidad del 1-MT y mejorar la biodisponibilidad del fármaco. En segundo lugar, las células B16F10 pueden endocitar eficazmente PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT para liberar 1-MT y GOx en respuesta a las ROS intracelulares y las ROS adicionales generadas por GOx. Por lo tanto, una cantidad abundante de 1-MT podría inhibir significativamente la IDO y recuperar la actividad de las células T. Estos resultados confirman el importante potencial del nanosistema para mejorar la inmunidad antitumoral in vivo.

La capacidad de escape lisosomal del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT es vital para mantener la bioactividad de GOx y lograr el daño tumoral deseado. Se utilizó CLSM para monitorear el escape lisosomal del nanosistema, determinado a partir del grado de coincidencia entre la fluorescencia verde (nanosistema marcado con FITC) y la fluorescencia roja (lisosomas marcados con rojo lisotracker)34. Al incubar las células B16F10 con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante 1 h, se observó que la fluorescencia verde marcada como PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT estaba distribuida en gran medida en el borde de la membrana celular ( Fig. 7a), lo que demuestra un signo natural de endocitosis. Como la duración de la incubación se prolongó a 3 h, casi todo el PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se localizó en los lisosomas, como lo revela la fluorescencia amarilla brillante bien combinada. Además, la fluorescencia verde marcada como PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se transfirió de los lisosomas al citoplasma a medida que la duración de la incubación se prolongó a 8 h, lo que indica un escape exitoso del lisosoma. El nanosistema funcionalizado con PEI podría inducir la alteración de la membrana lisosomal a través de la protonación inherente de PEI35,36, lo que resultaría en el escape del lisosoma y en la liberación citoplasmática de GOx y 1-MT para matar las células tumorales.

a Células B16F10 incubadas con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT marcadas con FITC durante diferentes tiempos, seguido de tinción con rojo Lysotracker para obtener imágenes del escape del lisosoma, con imágenes representativas de 3 experimentos. b, c FCM y análisis cuantitativo de apoptosis de células B16F10 después de diferentes tratamientos durante 24 h. d – f Proteínas asociadas a la apoptosis en células B16F10 después del tratamiento con los sistemas indicados examinados mediante transferencia Western (d) y el análisis cuantitativo relacionado de Bax/Bcl-2 (e) y citocromo C (f). g – i Imágenes de microscopía (g) y análisis cuantitativo de la cicatrización y migración de heridas (h), así como ensayos de invasión (i) de células B16F10 después del tratamiento con estos sistemas. Los datos representan la media ± DE (n = 4 muestras biológicamente independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01. Barras de escala: 20 μm para a, 100 μm para g.

Posteriormente, se emplearon FCM y CLSM para monitorear con precisión la relación apoptosis/muerte de las células B16F10 incubadas con las diversas muestras usando anexina V-FITC/PI (PI: yoduro de propidio) y kits de tinción de muertos vivos. Como se muestra en la Fig. 7b, en comparación con el control, se observó un bajo grado de apoptosis y una tasa de muerte (6,58%) en el vehículo en blanco PCP-Mn-DTA tras la incubación durante 24 h, lo que implica su compatibilidad superior. La 1-MT libre provocó un grado moderado de apoptosis, que obviamente fue menor que la de PCP-Mn-DTA@1-MT (12,91% frente a 21,7%, p <0,01, Fig. 7c), gracias a la citotoxicidad natural de 1-MT37 y el efecto de entrega del nanosistema. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT provocó una apoptosis grave (47,4%), como resultado del daño por inanición/oxidación generado por GOx. Se observó una generación obvia de H2O2 y una inhibición de la producción de ATP por los sistemas cargados con GOx (PCP-Mn-DTA@GOx y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, Figura complementaria 10). Además, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT más glucosa generó la proporción de apoptosis más alta en todos los tratamientos (54,1%), y el ensayo de muertos vivos también reflejó una tendencia similar a la destrucción de tumores (Figura complementaria 11). Los resultados anteriores confirmaron exhaustivamente la eficacia superior del nanosistema en la eliminación de tumores.

Para ilustrar mejor el mecanismo de apoptosis inducido por el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, se empleó el ensayo de transferencia Western para evaluar la expresión de las proteínas de apoptosis relacionadas, incluidas Bax, Bcl-2 y Cyt-C. Como se demuestra en la Fig. 7d, se observó una leve regulación positiva de la relación Bax/Bcl-2 y Cyt-C en el grupo de 1-MT libre en comparación con el control, mientras que PCP-Mn-DTA@1-MT indujo una expresión más obvia. tendencia que la de 1-MT, lo que confirma la citotoxicidad inicial de 1-MT y la eficiencia de entrega intensiva del nanosistema. Además, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT condujo a una notoria regulación positiva de Bax y Cyt-C, así como a una regulación negativa de Bcl-2, atribuida al efecto combinado del daño por inanición/oxidación mediado por GOx y 1 -Citotoxicidad provocada por MT. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT más glucosa indujeron la mayor regulación positiva de la expresión de Bax/Bcl-2 y Cyt-C entre todos los grupos (Fig. 7e, f), lo que indica el efecto antitumoral superior causado por PCP- Mn-DTA@GOx@1-MT.

Como el metabolismo energético regulado por GOx y 1-MT estaba estrechamente asociado con la migración del tumor38,39, el grado de antimigración de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se evaluó mediante la cicatrización de heridas, la migración del tumor y la invasión. estudios. Como se muestra en la Fig. 7g, los grupos de control y PCP-Mn-DTA exhibieron un fuerte comportamiento de curación, reflejado por la desaparición de los rayones. Sugirió que las células B16F10 tenían características metastásicas inherentes. 1-MT y PCP-Mn-DTA@1-MT demostraron un modesto efecto anti-migración con tasas de curación del 75% y 58%, respectivamente (Figura complementaria 12). El grupo PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT indujo la tasa de curación más baja del 39%, lo que indicó la inhibición de la motilidad celular más efectiva. Además, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT también mostró la mayor supresión de migración e invasión con tasas de cobertura del 30,1% y 24,9%, respectivamente (p <0,01, Fig. 7h, i), como lo revela la expresión y análisis cuantitativo de las proteínas asociadas a la invasión tumoral (E-Cadherin, MMP2 y MMP9, figura complementaria 13). Como resultado, se obtuvo un alto efecto antitumoral y antimetástasis in vitro debido a la acción combinada del daño por inanición/oxidación mediado por GOx, la citotoxicidad causada por 1-MT y la regulación inmune, que fueron respaldados aún más por el posterior sistema inmunológico in vivo. ensayos de respuesta.

Para validar la respuesta inmune antitumoral del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, FCM analizó cuantitativamente las células T inmunes relevantes en los sitios del tumor en los ratones portadores de tumores B16F10 y 4T1. Como se demuestra en las figuras 8a – d y complementarias. 14 y 15, se observó una gran cantidad de células Treg y una pequeña cantidad de células T citotóxicas (CTL) infiltrantes de tumores en el grupo de control, atribuidas a la resistencia inmune innata. Mientras tanto, la cantidad de CTL mostró un aumento moderado, mientras que las células Treg mostraron una pequeña disminución en el grupo de 1-MT libre. PCP-Mn-DTA@1-MT demostró una tendencia superior que la 1-MT libre, lo que se atribuyó a la supresión aliviada de la actividad de las células T efectoras y a la inhibición de la proliferación de células Treg mediante el bloqueo de IDO40,41, así como a una alta eficiencia de administración del fármaco. Sorprendentemente, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT indujo la mayor extensión de CTL infiltrantes de tumores y la menor cantidad de células Treg, independientemente de los modelos de ratón con tumores B16F10 y 4T1 (p <0,01, Fig. 8b, d) , lo que indica la activación de la respuesta inmune reforzada con una evasión inmune suprimida. En particular, la proporción de células T auxiliares CD4+ en los grupos cargados con 1-MT libre y 1-MT disminuyó en los ratones con tumor B16F10 (Figura 16 complementaria), lo que concordó con los estudios informados anteriormente 9,42.

a, c FCM y (b, d) análisis cuantitativo de las poblaciones de células citotóxicas T CD8+ infiltrantes de tumores, células Treg, células NK, células dendríticas y células B de ratones C57BL/6 portadores de tumores B16F10 y tumores 4T1. con ratones Balb/c después de 4 días después de la administración, respectivamente. e Cambios en la relación Kyn/Trp del modelo de tumor B16F10 después del tratamiento anterior durante 4 días. f Imágenes IFC de secciones de tumores teñidas con anti-IDO, anti-mTOR y anti-STAT3, con imágenes representativas de 3 experimentos. Barra de escala: 100 µm. Los datos representan la media ± DE (n = 6 muestras biológicamente independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01.

IDO1 puede catalizar el metabolismo de Trp a Kyn, lo que conduce a la inhibición directa del objetivo de la rapamicina en los mamíferos (mTOR) y a la activación de los transductores de señal/activadores de la transcripción (STAT3) a través de la vía AHR-IL-6-STAT343. 44,45. La proporción de Kyn a Trp, la expresión de IDO1 intratumoral, mTOR y STAT3 pueden actuar como indicadores para revelar el mecanismo de resistencia inmune aliviado del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. Como se muestra en la Fig. 8e, f, tanto PCP-Mn-DTA@1-MT como PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT inhibieron efectivamente la expresión de IDO, como se manifiesta también por la proporción más baja de Kyn intratumoral a Trp. como una importante regulación a la baja de IDO1. Además, se observó una regulación positiva obvia de mTOR y una regulación negativa de STAT3 en los grupos PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, lo que implica que el nanosistema cargado con 1-MT efectivamente bloqueó la resistencia inmune mediada por IDO1 y mejoró la respuesta inmune.

Como la destrucción eficaz de las células tumorales se asocia positivamente con el nivel de células dendríticas maduras, así como con el refuerzo de la activación de la respuesta inmune al exponer los TAA y presentar la señal "cómeme"46, se investigó más a fondo la proliferación de las células dendríticas maduras. ilustran el mecanismo del nanosistema para estimular la respuesta inmune. Como se demuestra en la Fig. 8b, d y en la Fig. 17 complementaria, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT promovieron la maduración de las células dendríticas, con la secuencia 1- MT < PCP-Mn-DTA@1-MT < PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, confirmando así el reclutamiento efectivo de las células dendríticas. Curiosamente, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT también presentó el mayor reclutamiento de células NK y B intratumorales en ratones portadores de tumores B16F10 o 4T1 (p <0,01, Fig. 8b, d, y Figs. complementarias 18). y 19). Se podría sugerir que PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podría inducir eficazmente el daño tumoral mediante la terapia de inanición/oxidación mediada por GOx (Fig. 5a y Fig. 7b-f). Por lo tanto, la inmunogenicidad tumoral mejorada y la exposición de los TAA reforzaron significativamente el reclutamiento intratumoral de las células T efectoras, y la supresión de la resistencia inmune iniciada por 1-MT (Fig. 6 y 8b, d) impulsó aún más la respuesta inmune antitumoral general. Aprovechando la terapia de inanición/oxidación desencadenada por GOx y la inmunoterapia de bloqueo IDO mediada por 1-MT, el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT fortaleció eficazmente la respuesta inmune antitumoral sistémica.

Para autentificar la ventaja de la terapia combinada de inanición/oxidación y la inmunoterapia con bloqueo de IDO, la evaluación antitumoral se realizó simultáneamente in vivo en modelos de ratón con tumores B16F10 y 4T1. En estos modelos, el grupo PCP-Mn-DTA exhibió un rápido crecimiento tumoral similar al control (Fig. 9a, a'), lo que indica el efecto antitumoral insignificante del portador vacío. Además, los grupos 1-MT libre y PCP-Mn-DTA@1-MT exhibieron una inhibición leve y moderada del crecimiento tumoral, atribuida a la inmunoterapia individual y a la eficiencia avanzada de la administración. Más importante aún, el grupo PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT indujo la inhibición del crecimiento tumoral más obvia sin una pérdida significativa de peso corporal (Figura complementaria 20), lo que indica la terapia antitumoral más efectiva con efectos secundarios reducidos. El análisis del volumen del tumor (Fig. 9b, b') confirmó además la tendencia similar de la inhibición del crecimiento del tumor. Además, el grupo PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT prolongó notablemente el tiempo de supervivencia de los ratones con tumores más allá de 30 días (67% y 50% en los modelos de tumores B16F10 y 4T1, Fig. 9c, c'). , que fue mucho mayor que en los otros grupos de tratamiento. En particular, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT también demostró el efecto inhibidor más fuerte sobre la metástasis pulmonar (Fig. 9d, d'), como lo verifica la correspondiente tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los tejidos pulmonares y análisis de cuantificación posterior (Fig. 9e, e').

a, a' Fotografías de ratones portadores de tumores B16F10 (a) y 4T1 (a') después de tratamientos con solución salina, Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante 0, 7 y 18 días, respectivamente. b, b' Volúmenes tumorales y (c, c') tasas de supervivencia de ratones después de diversos tratamientos. d, d' Fotografías de tinción H&E y (e, e') análisis cuantitativo de los nódulos metastásicos de ratones portadores de tumores de pulmón metastásicos B16F10 y 4T1, respectivamente. Imágenes de tinción de f, f' TUNEL, H&E y Ki67 para tumores. g Imágenes fotoacústicas de hemoglobina oxigenada (HBO2) y hemoglobina (HB), y (h) señales de melanina en sitios tumorales en ratones después de la inyección intratumoral con GOx o PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante varios intervalos de tiempo, con imágenes representativo de 4 experimentos. Barra de escala: 100 µm para d, d', f y f'. Los datos representan la media ± DE (n = 6 muestras biológicamente independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01.

Los excelentes efectos antitumorales y antimetástasis del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podrían explicarse de la siguiente manera. En primer lugar, el nanosistema dotado de la transformación de tamaño/carga sensible al pH podría aumentar notablemente la permeabilidad del tumor y la captación celular, mejorando así la eficacia de administración y la biodisponibilidad de GOx y 1-MT. En segundo lugar, GOx de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podría matar eficazmente las células tumorales y exponer los TAA mediante inanición/oxidación47, lo que lleva a un reclutamiento eficaz de las células T efectoras. Además, 1-MT de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podría suprimir significativamente la expresión de IDO y aliviar la tolerancia inmune mediada por IDO, lo que resulta en el reclutamiento de CTL, células B y células NK, así como la inhibición de Treg. proliferación celular. Por último, el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT combinado con la terapia de inanición/oxidación y la inmunoterapia con bloqueo IDO proporcionó el efecto antitumoral más significativo con una activación inmune reforzada y una tolerancia inmune debilitada.

Posteriormente, se realizaron análisis de tinción con H&E, desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP (TUNEL) y tinción por inmunofluorescencia (IFC) para demostrar aún más la actividad antitumoral integral del nanosistema in vivo. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT indujo el daño tumoral más grave, como lo revela la clara disociación del tejido en las imágenes H&E y numerosos puntos magenta en la observación TUNEL (Fig. 9f, f'). Además, el análisis IFC de Ki67 en los tejidos tumorales confirmó que PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT regulaba efectivamente la expresión de Ki67, confirmando su efecto antitumoral superior.

La bioimagen fotoacústica no invasiva se realizó para medir el nivel de oxígeno en sangre intratumoral (sO2 promedio) y la producción de H2O2 después de la inyección intravenosa de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. Las imágenes fotoacústicas y los resultados cuantitativos indicaron que el promedio de sO2 mostró una caída de ~81% después de la administración de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante 24 h, y la intensidad de las imágenes fotoacústicas del sitio del tumor aumentó correspondientemente (Fig. .9g y Fig. complementaria 21). En comparación, el grupo GOx no mostró cambios significativos. La razón podría explicarse de la siguiente manera: (1) las ROS intratumorales aceleraron la liberación de GOx del nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, y la GOx liberada consumió el oxígeno endógeno y “mató de hambre” al tumor, resultando así en el agravamiento de la acidez local y del nivel de H2O2; (2) la generación de H2O2 inducida por GOx amplificó aún más el desmontaje del nanosistema y la liberación de GOx a través de una reacción en cascada; (3) el radical ·OH generado a partir de la reacción tipo Fenton entre Mn2+ y H2O2 también contribuyó a la señal fotoacústica aumentada48. En particular, el análisis cuantitativo de melanina en ratones demostró que PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT redujo significativamente la cantidad de melanina intratumoral, mientras que hubo un cambio insignificante en el grupo GOx negativo (Fig. 9h y Fig. Suplementaria 22). ). Estos resultados indicaron que el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT generó efectivamente ROS y redujo la melanina, lo que condujo a un efecto de destrucción de células tumorales significativamente mejorado.

Además, se estudió la seguridad biológica del nanosistema. En primer lugar, el PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT no indujo una disminución continua en la glucosa en sangre periférica en comparación con el control (Fig. 10a), lo que sugiere su seguridad sanguínea superior. En segundo lugar, los niveles bioquímicos en sangre, así como los parámetros hematológicos (valor de hematocrito, volumen medio de plaquetas, hemoglobina, plaquetas, hemoglobina corpuscular media, glóbulos rojos, concentración de hemoglobina corpuscular media, ancho de distribución de los glóbulos rojos, volumen corpuscular medio y glóbulos blancos). , los índices de función hepática (aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa) y los índices de función renal (nitrógeno ureico en sangre y creatinina) se mantuvieron sin cambios después de la inyección con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT con el tiempo (Figura complementaria 23), lo que confirma una biocompatibilidad superior49. En tercer lugar, no se observó daño orgánico evidente ni pérdida de peso corporal en el caso del grupo PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT en los modelos tumorales B16F10 y 4T1, como lo revela el análisis histológico y H&E (Figuras complementarias 20, 24), confirmando así la bioseguridad óptima in vivo. Más importante aún, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT también prolongó significativamente el tiempo de circulación de 1-MT (Figura complementaria 25) y acumuló efectivamente 1-MT en el sitio del tumor con una dosis más alta (casi 5 veces) como en comparación con 1-MT gratis. Además, la cantidad de acumulación de fármaco en el tumor fue significativamente mayor que en otros tejidos (p < 0,01), atribuido al efecto de protección y carga negativa dotada por la capa externa de PEG50, así como al tamaño reducido y al diseño de inversión de carga del nanosistema. .

a Cambios en el nivel de glucosa en sangre después de 1 h después del tratamiento. b Procedimientos del tratamiento para estudiar el grado de recurrencia del tumor. c, c' Proporción de recurrencia tumoral de ratones portadores de tumores B16F10 y 4T1 después de varios tratamientos. d, d' FCM y (e, e') análisis cuantitativo correspondiente sobre la frecuencia de células TEM y TCM en el bazo el día 8 cuando se vuelven a desafiar ratones con tumores secundarios B16F10 y 4T1. Los datos representan la media ± DE (n = 6 muestras biológicamente independientes). Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student no apareada (de dos colas), **p < 0,01. Los diagramas de caja indican la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los percentiles 5 y 95 (bigotes), así como valores atípicos (puntos únicos).

Por último, se realizaron la nueva exposición al tumor y la respuesta secundaria de los ensayos de células T de memoria inmunitaria para evaluar sistemáticamente la persistencia del efecto inmunitario protector y la posible aplicación clínica del nanosistema (Fig. 10b). Como se muestra en la Fig. 10c, c', PCP-Mn-DTA, 1-MT y PCP-Mn-DTA@1-MT demostraron altos niveles de recurrencia tumoral (83,3% -100%), similares al grupo de control después de 25 días. de tratamiento. En comparación, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mostró una reducción significativa en la tasa de recurrencia al 33,3 % y 50 % en los ensayos de reexposición tumoral basados ​​en B16F10 y 4T1, respectivamente, lo que sugiere una inhibición efectiva de la recurrencia del tumor. Además, el tratamiento con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT aumentó significativamente la proporción de células T efectoras de memoria (TEM) en el día 8 (Fig. 10d, e y 10d', e') y 50 (Fig. 26 complementaria). ) bajo la segunda infusión de tumor, mientras que la cantidad de células T de memoria central (MTC) disminuyó correspondientemente (p < 0,01). Confirmó el efecto de la respuesta inmune secundaria a largo plazo. Los resultados indicaron que el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT podría iniciar con éxito la respuesta de memoria inmune con una eficacia duradera. Por lo tanto, el nanosistema multifuncional PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT con capacidades de reducción de tamaño y conversión de carga podría matar sinérgicamente las células tumorales y suprimir la metástasis del tumor a través de ventajas combinadas de iniciación de respuesta inmune reforzada por inanición/oxidación e IDO- bloquear la supresión de la tolerancia inmune.

En este estudio, se ha desarrollado un nanosistema basado en nanorreactor MOF degradable de respuesta dual pH/ROS con liberación autoamplificada y penetración mejorada para administrar conjuntamente GOx y 1-MT para la terapia combinada de inanición/oxidación e inmunoterapia con bloqueo IDO de tumores. Los resultados detallados in vitro e in vivo han autentificado que el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT no solo supera estratégicamente las biobarreras y mejora la eficiencia de administración a través de la transición de tamaño/carga sensible al microambiente tumoral débilmente ácido, sino que también refuerza eficazmente la activación de la respuesta inmune con una tolerancia inmune reducida a través de la terapia de inanición/oxidación activada por GOx y la inmunoterapia con bloqueo IDO. Aprovechando estas estrategias, el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT suprime eficazmente el crecimiento tumoral y la metástasis. Por lo tanto, este estudio proporciona un paradigma prometedor para superar las biobarreras y reforzar la activación de la respuesta inmune, así como aliviar la resistencia inmune mediante la inmunoterapia de bloqueo IDO integrada por inanición/oxidación.

Se disolvió ácido 3-mercaptopropiónico (4,9 mmol) en acetona (9,82 mmol) y se agitó durante 8 h. Posteriormente, la solución se cristalizó en un baño de hielo durante la noche. Los cristales filtrados se lavaron repetidamente con agua fría y hexano, seguido de secado al vacío para obtener el compuesto 1 (rendimiento 81%). RMN 1H (400 MHz, CD3OD, ppm): 2,85 (t, 4H, -SCH2CH2-), 2,58 (t, 4H, -CH2CH2COOH), 1,58 (s, 6H, -SCCH3CH3S-). ESI-MS: Calc. 251.0417, encontrado 251.0404. La RMN 1H y los espectros de masas se presentaron en las figuras 2a, b.

La solución de MnCl2 (107 μL, 50 mg mL-1 en DMF), el compuesto 1 (347 μL, 15 mg mL-1 en DMF), la polivinilpirrolidona (K30, 300 mg) y la trietilamina se agregaron a un tubo de centrífuga. Posteriormente, se añadió la mezcla de DMF/etanol hasta que el volumen fue de 13 ml. Posteriormente, la solución se transfirió a un reactor y se mantuvo a 150 °C durante 24 h. Finalmente, el producto, denominado Mn-DTA, se recogió mediante centrifugación (18.500 g) y se volvió a dispersar en etanol para su uso posterior.

Brevemente, se disolvieron anhídrido cis-aconítico (donado como CDM, 1 equiv.) y cloruro de oxalilo (2 equiv.) en diclorometano seco a 0 °C. A continuación, se añadió DMF gota a gota y la mezcla se transfirió a condiciones de temperatura ambiente durante 2 h. El CDM acetilado con cloruro se recogió mediante secado al vacío y luego se hizo reaccionar con mPEG-OH en presencia de piridina durante otras 2 h. Luego se añadió el cloruro de amonio saturado para terminar la reacción. La fase orgánica se extrajo y precipitó dos veces con éter enfriado con hielo. El compuesto 2 (PEG-CDM) se recogió mediante secado al vacío. RMN 1H (400 MHz, CDCl3, ppm): 7,95 (s, 1H, -CCHCOO-), 3,71 (m, 464H, -OCH2CH2-), 3,45 (s, 3H, -OCH3) y 2,93 (s, 2H, - OOCH2COO-). FTIR: 2885, 1726, 1633, 1569, 1471 y 1115 cm-1. Los espectros de 1H NMR y FTIR de 2 se mostraron en la Fig. 4a complementaria y la Fig. 5 complementaria, respectivamente.

Se mezclaron PEI ramificada (0,9 mmol) y el compuesto 2 (0,6 mmol) con dimetilsulfóxido (DMSO, 10 ml) a 0 °C. Después, se añadió gota a gota 4-dimetilaminopiridina (1,2 mmol) y se agitó durante 0,5 h. Los contenidos de la reacción se calentaron a temperatura ambiente en la oscuridad y la reacción continuó durante 2 h. Luego se dializó la mezcla (MWCO 3,5 kDa) frente a agua bidestilada durante 3 días. El compuesto 3, también denominado PEG-CDM-PEI, se consiguió mediante liofilización (rendimiento: 82%). RMN 1H (400 MHz, D2O, ppm): 3,83 (m, 464H, -OCH2CH2-), 3,31 (s, 3H, -OCH3) y 2,62-2,97 (t, -CH2CH2N-). Se determinó que el peso molecular era 7200 mediante GPC, con un índice de polidispersidad de 1,29. FTIR: 2885, 1739, 1645, 1562, 1471 y 1116 cm-1. Los espectros de 1H NMR, GPC y FTIR de 3 se mostraron en las figuras complementarias 4b, c y 5 complementarias, respectivamente.

Se disolvieron Mn-DTA (10 mg), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetil amino propil) carbodiimida (EDC·HCl, 6 mM) y N-hidroxisuccinimida (NHS, 6 mM) en PBS (pH 7,4, 10 ml). Después de agitar durante 1,5 h, se añadió el compuesto 3 (0,06 mmol) a la solución, que se hizo reaccionar durante otras 36 h. El producto, denominado PCP-Mn-DTA, se recogió mediante centrifugación (18.500 g) y secado al vacío.

Se disolvieron Mn-DTA (10 mg), GOx (1,33 mg) y 1-MT (2 mg) en PBS (pH 7,4). Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 h, la mezcla se centrifugó (18.500 g), seguido de resuspensión en PBS (pH 6,0, 10 ml) que contenía EDC · HCl (15 mM) y NHS (15 mM). La conjugación del compuesto 3 se realizó de manera similar a la síntesis de las nanopartículas de PCP-Mn-DTA. Finalmente, el PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT cargado con el fármaco se recogió mediante centrifugación (18.500 g) y liofilización.

La carga de GOx y 1-MT en PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT se cuantificó mediante espectroscopia UV-vis basada en las curvas estándar de GOx a 276 nm y 1-MT a 288 nm, respectivamente. El contenido de carga de fármaco (DLC) y la eficiencia de carga de fármaco (DLE) se calcularon mediante las siguientes ecuaciones:

Para detectar la actividad de GOx cargado en el nanosistema PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, se mezcló glucosa (1 mg/mL) con GOx libre (200 μg/mL) o una cantidad equivalente de PCP cargado con GOx. -Mn-DTA@GOx@1-MT (2,27 mg/mL). El sobrenadante se extrajo en diferentes intervalos de tiempo (0 h, 0,1 h, 0,5 h, 1 h, 1,5 h y 2 h), y se monitoreó la generación de H2O2 y el cambio de pH.

Primero se disolvió PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (3 mg) en PBS (1 ml, pH 7,4) sin o con diferentes concentraciones de H2O2 o glucosa, seguido de la transferencia a las bolsas de diálisis. Posteriormente las bolsas de diálisis se sumergieron en PBS (29 mL) con diferentes condiciones bajo agitación (100 rpm) a 37 °C. El medio (0,7 ml) se extrajo en los intervalos de tiempo deseados (1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 12 h, 24 h y 48 h) y las bolsas se refrescaron con el mismo volumen de PBS. El GOx liberado se midió mediante espectroscopia UV-vis a una longitud de onda de 276 nm.

Brevemente, se incubó PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (1 mg/mL) con suero bovino fetal (SFB) al 10% en PBS (pH 7,4 y 6,8) a 37 °C durante 6 días. La solución de muestra se extrajo en intervalos de tiempo específicos (0 h, 6 h, 18 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h y 144 h) y DLS la detectó para analizar los cambios en el tamaño. de PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT.

Las células de melanoma B16F10 se adquirieron del Banco de células de la Academia de Ciencias de China, China. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 1% (p/v) de penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 µg/ml) y 10% (v/v) de FBS con 5% de CO2 a 37 ºC.

Para evaluar la citotoxicidad, las células B16F10 (2 x 104 células por centímetro cuadrado) sembradas en placas de 24 pocillos se trataron con PBS, 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA (11,36 μg/mL), PCP -Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/mL, equivalente a 10 mU/mL de GOx y 7 μM 1-MT) y PCP-Mn-DTA@GOx@ 1-MT + glucosa (glucosa 5,5 mM) durante 24 h y 48 h, seguido de incubación con la solución de mezcla compuesta por 200 μl de medio fresco y 20 μl de CCK-8 a 37 °C durante otras 1,5 h. La absorbancia a 450 nm se registró mediante un lector de microplacas espectrofotométrico (Bio-Rad 680, EE. UU.).

CLSM observó la endocitosis de las células B16F10 en el nanosistema PCP-Mn-DTA y FCM la analizó cuantitativamente. Por un lado, las células B16F10 sembradas en la placa del microscopio confocal se trataron con PBS, GOx marcado con FITC (GOx-FITC, 10 mU/mL) y PCP-Mn-DTA@GOx-FITC@1-MT a pH 7,4 y 6,8 durante 4 y 12 h. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con TritonX-100 al 0,5% y se tiñeron con ActinRed 555 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se emplearon CLSM (LSM 510 META Olympus) y el software CellSens Dimension para estudiar la eficiencia de la absorción por las células B16F10. Por otro lado, las células B16F10 tratadas con los distintos sistemas se lavaron con PBS. Posteriormente, las células se centrifugaron (800 g x 10 min) a 4 °C y se recogieron. Finalmente, se resuspendieron en la solución de unión celular (300 μL) y se analizaron mediante FCM (FACS Calibur and Celesta, BD, Biosciences) y el software FlowJo_V10.

Normalmente, se utilizó DCF-DA como sonda de ROS para controlar la generación de ROS en las células B16F10. Brevemente, las células B16F10 sembradas en placas de 6 pocillos o placas de microscopio confocal se trataron con GOx, PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@GOx, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT y PCP-Mn. -DTA@GOx@1-MT + glucosa con la misma concentración de GOx. CLSM tomó imágenes de la generación de ROS celular y FCM analizó cuantitativamente.

En primer lugar, se vertió una solución de agarosa caliente (1,5%) en una placa de 96 pocillos (80 µl por pocillo), que se enfrió para formar una capa de agaropectina. A continuación, se formaron MCS después de incubar células B16F10 en esta placa durante aproximadamente una semana19. A continuación, los MCS se transfirieron a dos placas de 6 pocillos que contenían DMEM con diferentes valores de pH, seguido del tratamiento con nanopartículas PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/mL) marcadas con FITC durante 4 y 12 h. Las MSC resultantes se lavaron con PBS, se resuspendieron en medio fresco y posteriormente se detectaron mediante CLSM.

Brevemente, las células B16F10 positivas transfectadas con IDO1 (el gen IDO1 se transfectó con Lipofectamine®3000, gen NCBI) y las células B16F10 se incubaron con PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante 24 h, respectivamente. A continuación, las células se lisaron y se obtuvieron mediante centrifugación (800 g x 10 min, 4 °C). Se utilizó el análisis de transferencia Western para medir la expresión de IDO1.

Se mezclaron células B16F10 estimuladas con IFN-γ (1 x 105 células/pocillo) con células T (5 x 105 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos, seguido de tratamiento con 1-MT, PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, respectivamente. Después de 12 h de cocultivo, los linfocitos se obtuvieron y se incubaron con EdU (10 μM) para el análisis de FCM.

Después de que la confluencia de las células B16F10 sembradas en las placas del microscopio confocal alcanzó el 60-70 %, las células se incubaron con PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT marcado con FITC (11,36 μg/ml) y rojo Lysotracker (1 μM). a 37 °C durante 1, 3 y 8 h. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se observaron mediante CLSM.

Una vez que la confluencia de las células B16F10 sembradas en una placa de 6 pocillos alcanzó el 60-70%, las células se trataron con PBS (Control), 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA (11,36 μg/mL), PCP-Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/mL, equivalente a 7 μM 1-MT) y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT + glucosa ( Glucosa 5,5 mM) durante 24 h. Posteriormente, las células se obtuvieron mediante centrifugación (800 g) y se tiñeron con el kit Anexina V-FITC/PI (NeoBioscience) según las instrucciones, seguido del análisis FCM.

Las células B16F10 sembradas en placas de 6 pocillos se trataron con PBS, 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT ( 11,36 μg/mL, equivalente a 7 μM 1-MT) y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT + glucosa durante 24 h, respectivamente. Posteriormente, las células se lisaron y las muestras de proteínas se recogieron mediante centrifugación (18.500 g). Se utilizaron transferencia Western (Gel DocTM XR +, Bio-Rad) y el software ImageJ 1.45 f para monitorear y analizar la expresión de Bax, Bcl-2 y Cyt-C (Figura complementaria 27).

Las células B16F10 se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h. Después del tratamiento con PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante 24 h, se produjo una herida rayada al herir la célula confluente. monocapas con punta de pipeta p200. Posteriormente, las células se lavaron para eliminar el nanosistema. Después de 24 h, las imágenes de la cicatrización de las heridas se adquirieron utilizando un microscopio (Olympus).

Las células B16F10 se trataron con los diferentes sistemas utilizados en este documento durante 24 h. Posteriormente, las células fueron digeridas y recogidas mediante centrifugación (800 g). Para el experimento de migración celular, las células se resuspendieron en un medio sin suero y posteriormente se transfirieron a la cámara superior de Transwell a una densidad de 1 x 105 células. Para el experimento de invasión, se cultivaron 2 x 105 células B16F10 en el gel de matriz precubierto de Transwell. Mientras tanto, se añadió a la cámara inferior un medio que contenía un 10% de FBS como atrayente químico. Después de una incubación durante 24 h, las células de la superficie inferior de Transwell se tiñeron con cristal violeta. Posteriormente fueron contados y fotografiados mediante un microscopio.

Se adquirieron ratones C57BL/6 y ratones Balb/c (de aproximadamente 6 semanas de edad) del Instituto de Control de Drogas de Beijing (China). Todos los animales fueron criados en instalaciones libres de patógenos con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y una humedad relativa (40–70%) a 21 ± 2 °C. Todos los ratones tuvieron acceso a comida y agua ad libitum. Los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Politécnica Northwestern. Los modelos de ratón con tumores se establecieron inoculando células B16F10 o 4T1 (100 µl, concentración de 1 × 106) en PBS en el flanco derecho de los ratones C57BL/6 o Balb/c19. Una vez que el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 50 mm3, a siete grupos de ratones portadores de tumores se les inyectó por vía intravenosa solución salina, Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP. -Mn-DTA@GOx@1-MT a dosis de 3 mg/kg 1-MT (n = 6). Estos tratamientos se realizaron dos veces por semana y duraron 18 días. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones se midieron cada 2 días. El volumen del tumor (V) se calculó mediante la ecuación:

donde L es la dimensión más larga del tumor y S es la dimensión más corta del tumor. Después del último tratamiento, se registró la tasa de supervivencia del ratón durante otros 15 días.

A los ratones portadores de células B16F10 y 4T1 se les inyectaron por vía intravenosa las mismas siete formulaciones. Las inyecciones se realizaron dos veces cada 2 días. Posteriormente, los tejidos tumorales se extirparon, digirieron y recogieron en linfocitos monodispersivos. Los linfocitos obtenidos se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-CD4-FITC, anti-CD3-APC/Cy7 y anti-CD8-Percp/Cy5.5 para analizar las células T CD4+ (CD3+CD4+CD8−) y CD8+ ( CD3+CD4−CD8+), comarcado con anti-CD3-APC/Cy7 y anti-CD49b-PE/Cy7 para el análisis de las células NK (CD3−CD49b+), comarcado con anti-CD3-APC/Cy7 y anti -CD45R/B220-PE para analizar las células B (CD3−CD45R/B220+), comarcado con anti-CD80-APC, anti-CD86-PE y anti-CD11b-FITC para analizar las células dendríticas maduras (CD11b+CD80 +CD86+), y comarcado con anti-CD4-FITC, anti-Foxp3-Alexa 647 y anti-CD3-APC/Cy7 para el análisis de las células Treg mediante FCM, según los procedimientos del fabricante.

Los esplenocitos recolectados de los ratones tratados se marcaron con anticuerpos anti-CD44-FITC, anti-CD3-PerCP-Cy5.5, anti-CD62L-APC y anti-CD8-PE según los procedimientos del fabricante. Posteriormente se realizó la detección con FCM para medir las células T de memoria centrales y efectoras.

A los ratones portadores de células B16F10 se les inyectaron por vía intravenosa las formulaciones cada 3 días durante 5 veces. Las muestras de tumores se recogieron, homogeneizaron, centrifugaron y midieron mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas (HPLC-MS).

A los ratones portadores de tumores se les inyectó por vía intravenosa GOx o PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durante varios intervalos de tiempo. Las señales fotoacústicas de hemoglobina oxigenada, hemoglobina y melanina en los sitios tumorales se detectaron con iThera Medical MSOT inVision 128 (iThera Medical) y se analizaron con el software ViewMOST (versión 3.8.1.09).

Los ratones fueron sacrificados después del tratamiento durante 18 días. El bazo, el riñón, el pulmón, el corazón, el hígado y el tumor fueron resecados y divididos en secciones. Para el ensayo H&E, las secciones de los tejidos se tiñeron con H&E y se tomaron imágenes utilizando un microscopio (BX53, Olympus) con el software CellSens Entry. Para el ensayo TUNEL, las secciones del tumor se tiñeron con los agentes TUNEL (Beyotime) y se tomaron imágenes con un CLSM. Para el estudio IFC, las secciones del tumor se bloquearon con albúmina sérica bovina al 5 % y se incubaron con anticuerpo Ki67, IDO, mTOR o STAT3. Posteriormente, se tiñeron con IgG marcada con Alexa Fluor 488 o con un segundo anticuerpo marcado con Cy3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kit de tinción de fluorescencia Immunol, Beyotime, China). Finalmente, las secciones se tiñeron con DAPI y se caracterizaron utilizando un CLSM.

Se inyectaron por vía intravenosa a los ratones PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT junto con el control (solución salina). Después de 1 h de administración, se recogió la sangre para la determinación de glucosa en sangre. El nivel de glucosa en sangre de los ratones se midió utilizando un medidor de glucosa en sangre antes y después de la administración. Además, la sangre de los ratones se recogió directamente de los ojos después del último tratamiento. Las muestras de sangre se almacenaron a 4 °C durante la noche y se centrifugaron a 900 g durante 20 minutos para separar el plasma. Posteriormente se determinaron los niveles bioquímicos en sangre y parámetros hematológicos, así como los índices de función hepática y renal según los protocolos recomendados por los fabricantes.

A los ratones C57BL/6 portadores del tumor B16F10 se les inyectó por vía intravenosa 1-MT libre y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT en una dosis equivalente de 1-MT de 3 mg/kg. Para el estudio farmacocinético, en los intervalos de tiempo deseados, se extrajo sangre del plexo orbitario y se heparinizó. El plasma se recogió mediante centrifugación (2000 g). Luego se añadió acetonitrilo para precipitar las proteínas, seguido de una centrifugación a 18.500 g durante 8 minutos para recoger el sobrenadante. Finalmente, la muestra recolectada se secó, se volvió a disolver y se detectó mediante HPLC. Para el estudio de biodistribución, los ratones se sacrificaron después de 24 h, y el tumor y los órganos principales se recogieron y homogeneizaron en DMSO (0,5 ml), seguido de centrifugación a 16.000 g durante 15 min. La cantidad de 1-MT en estos órganos se determinó mediante HPLC.

Después de la inoculación del tumor primario, a los ratones C57BL/6 portadores de B16F10 y a los ratones Balb/c portadores de 4T1 (n = 6) se les inyectó por vía intravenosa solución salina (control), Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT. , PCP-Mn-DTA@1-MT y PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT los días -6, -4 y -2. Los tumores primarios se resecaron quirúrgicamente el día 0 y los ratones se volvieron a exponer por vía subcutánea a las células 4T1 o B16F10 y se controló la recurrencia de los tumores secundarios.

El análisis estadístico se realizó mediante el software OriginPro (versión 9.0 y 2022) mediante la prueba t de Student y análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los datos se expresaron como medias ± desviación estándar (DE). Los niveles de confianza del 95% y 99% se consideraron la diferencia significativa.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria y del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (52003223 (LD), 11722220 (HY) y 11672246 (HY)), el Programa Nacional Clave de I+D de China (2016YFC1100300 (KC)), el Programa Clave de I+D Programa de la provincia de Shaanxi (2022SF-012 (LD)) y el fondo de Jóvenes Talentos de la Asociación Universitaria de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (20200302 (LD)). Este trabajo fue parcialmente financiado por la subvención AME IRG de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur (A*STAR) (A20E5c0081 (YZ)) y la Investigación de la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (NRF-NRFI2018-03 (YZ)).

Instituto de Investigación Médica, Universidad Politécnica del Noroeste, Xi'an, 710072, República Popular China

Liangliang Dai, Zhenxiang Fu, Siyu Meng y Zhang Yuan

División de Química y Química Biológica, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Universidad Tecnológica de Nanyang, 21 Nanyang Link, Singapur, 637371, Singapur

Liangliang Dai y Yanli Zhao

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Politécnica del Noroeste, Xi'an, 710072, República Popular China

Mengjiao Yao, Xiang Li, Xinmin Zheng y Hui Yang

Laboratorio Clave de Ciencia y Tecnología Biorreológica, Facultad de Bioingeniería del Ministerio de Educación, Universidad de Chongqing, Chongqing, 400044, República Popular China

Kaiyong Cai

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LD concibió el proyecto. LD y MY diseñaron los experimentos y analizaron los resultados. MY y SM realizaron imágenes de microscopía confocal. MY, ZF y XL realizaron ensayos y análisis de transferencia Western. MY, ZF y XZ realizaron los estudios in vivo. Análisis histológico e inmunofluorescencia asistido por ZY. KC, HY e YZ proporcionaron las discusiones. El artículo fue escrito por LD, MY e YZ. Todos los autores contribuyeron a las discusiones generales y revisaron el artículo.

Correspondencia a Kaiyong Cai, Hui Yang o Yanli Zhao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Peng Huang y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Dai, L., Yao, M., Fu, Z. et al. Nanorreactor multifuncional basado en estructura organometálica para la inanición/oxidación mejoró la inmunoterapia tumoral con bloqueo de indoleamina 2,3-dioxigenasa. Nat Comuna 13, 2688 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30436-y

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Recibido: 07 de febrero de 2021

Aceptado: 20 de abril de 2022

Publicado: 16 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30436-y

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