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Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 3299 (2022) Citar este artículo

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La evaluación del dominio extracelular del estado del marcador oncomarcador del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2-ECD) es un factor impresionante en la detección, el diagnóstico y el seguimiento del cáncer de mama (CM) en etapa temprana. Se desarrolló un nanobiosensor electroquímico basado en aptámeros con alta sensibilidad y selectividad para la medición cuantitativa y cualitativa del marcador oncomarcador HER2-ECD. En este estudio, el nanocompuesto fabricado con distintos materiales incluía nanoláminas de óxido de grafeno reducido (rGON) y nanopartículas de rodio (Rh-NP) en la superficie del electrodo de grafito (GE). Esta estructura dio como resultado una actividad electroquímica amplificada, una alta superficie, estabilidad y biocompatibilidad. Cada uno de los pasos de la preparación de nanomateriales y la configuración del biosensor se examinó cuidadosamente mediante técnicas analíticas y electroquímicas. Se construyeron y analizaron varios electrodos modificados en términos de rendimiento electroquímico, morfología, tamaño y forma de nanomateriales. El aptasensor basado en GE tuvo resultados notables y favorables contra HER2-ECD con un amplio rango dinámico de 10,0 a 500,0 ng/ml, un límite bajo de detección (LOD) de 0,667 ng/ml (significativamente menor que el límite clínico ), y un límite bajo de cuantificación (LOQ) de 2,01 ng/ml. Los beneficios proporcionados por este aptasensor, como amplio rango dinámico, alta sensibilidad, selectividad, estabilidad, reproducibilidad y bajo costo, sugieren un enorme potencial para la detección y el monitoreo no invasivos de los niveles de HER2-ECD en la atención de BC y el diagnóstico clínico.

Hoy en día, la incidencia de enfermedades cancerosas es una gran amenaza para la salud humana1. Según las estadísticas publicadas en 2021, Columbia Británica, con una población de 2,26 millones de personas, tiene el mayor número de pacientes con cáncer en todo el mundo2,3. La BC es una enfermedad compleja que causa graves alteraciones en los niveles de genes, proteínas y metabolitos4. Es imposible brindar un tratamiento adecuado y oportuno sin un diagnóstico completo. Los métodos de prueba de diagnóstico sensibles, selectivos y rápidos no sólo allanan el camino para un tratamiento más eficaz, sino que también tienen un gran impacto en la prevención de una variedad de cánceres, especialmente el BC5. Por lo tanto, el cribado médico y la detección temprana del cáncer de mama mediante mediciones cuantitativas de marcadores oncológicos son esenciales para un seguimiento oportuno, mejorar la tasa de supervivencia y reducir la mortalidad6. Los procedimientos definitivos para diagnosticar las etapas primarias de BC incluyen mastografía, biopsia, ecografía y resonancia magnética (MRI). Además, para diagnosticar el CM en mujeres se utilizan técnicas basadas en la expresión y cuantificación génica, como la inmunohistoquímica (IHC), el radioinmunoensayo (RIA) y el enzimoinmunoensayo (EIA). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas enfrentan varias limitaciones, entre ellas una alta complejidad, ser demasiado caras y una reducción significativa de la sensibilidad y especificidad10,11,12. Por estas razones, los investigadores han priorizado el desarrollo de tecnologías de diagnóstico no invasivas, económicas, sensibles y fáciles de usar para monitorear la CM en momentos específicos para un tratamiento eficaz13. Como resultado, nuevas técnicas analíticas, como las pruebas en el lugar de atención (POCT, por sus siglas en inglés) para esta enfermedad en sus primeras etapas, brindan resultados más rápidos en el lugar de prestación de atención en entornos con recursos limitados, lo que permite un tratamiento oportuno y adecuado.

Los biosensores electroquímicos se han utilizado como una herramienta de diagnóstico prometedora para la determinación cualitativa y cuantitativa de marcadores oncológicos debido a su rápida reacción, facilidad de uso, bajo costo y bajo límite de detección. Al fabricar nuevos biosensores electroquímicos, es crucial seleccionar una matriz de electrodos impecable para optimizar la respuesta electroquímica14,15,16,17. Es necesario identificar los oncomarkers utilizados para la detección temprana, la recurrencia y el seguimiento de las metástasis del CM. HER2-ECD es uno de estos oncomarkers en el proceso de diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama mediante terapia dirigida a HER2. El mecanismo principal de sobreexpresión del receptor HER2-ECD es la amplificación de su oncogén que se encuentra en el cromosoma 17q12. La presencia de este marcador oncomar es esencial para el crecimiento y avance de ciertas neoplasias malignas agresivas como el cáncer de pulmón, ovario, mama, gástrico y oral18. La concentración de HER2-ECD en la sangre de personas sanas y pacientes con BC está en el rango de 4,0 a 14 ng/ml y de 15 a 75 ng/ml, respectivamente. que puede ser utilizado para el diagnóstico y vigilancia activa de pacientes en riesgo o en tratamiento19. HER2-ECD con niveles superiores a lo normal se denomina HER2 positivo o HER2+. Las personas que son identificadas como HER2+ en los procesos diagnósticos de CM, ingresan al protocolo de tratamiento con Herceptin. Herceptin es un anticuerpo monoclonal (Ab) específicamente diseñado y aprobado para apuntar a los receptores HER2 en la superficie de las células BC e impedir que reciban señales de crecimiento20.

La hibridación de nanomateriales de carbono con nanopartículas de metales nobles proporciona biosensores avanzados que tienen propiedades ópticas, mecánicas, químicas y eléctricas preferibles21. Los rGON poseen una alta superficie específica, alta conductividad eléctrica (en comparación con los GON), excelente biocompatibilidad y abundantes sitios químicamente activos para la funcionalización química y la catálisis. Debido a sus características físicas y químicas superiores, los rGON se han utilizado ampliamente en electrónica flexible, baterías, supercondensadores, sensores, etc. Sin embargo, los rGON tienen propensión a aglomerarse o reapilarse a través de fuerzas de van der Waals e interacciones de apilamiento pi-pi. Generalmente se utilizan estabilizadores o modificadores químicos para mejorar la dispersabilidad de los rGON, pero estos métodos a menudo disminuyen su rendimiento analítico. Recientemente, se han desarrollado varios métodos para prevalecer sobre la aglomeración de rGON. Una de las nuevas estrategias implica el ensamblaje de nanopartículas metálicas (NP) sobre grafeno para formar nanocompuestos híbridos22,23.

Las Rh-NP han surgido como una estrategia deseable y prometedora para decorar rGON debido a sus propiedades ventajosas que incluyen una gran superficie específica, excelente conductividad eléctrica, buena biocompatibilidad, alta adsorción biomolecular y estabilidad química24. Estas nanopartículas desempeñan un papel fundamental como monocapas autoensambladas, conductoras y estables en la superficie del nanocompuesto.

Se han investigado varios nanomateriales para diseñar y fabricar biosensores electroquímicos para detectar marcadores oncológicos cancerosos, incluidas nanocáscaras de oro multiramificadas y nanocopos de Pt funcionalizados con octreotida, GCE modificados para la detección de receptores de somatostatina25 y nanocompuestos de nanotubos de carbono y polianilina preparados en el electrodo de carbono para detección del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)26. Los biosensores construidos con electrodos desechables, como los electrodos de grafito, ofrecen un límite de detección bajo, un ensamblaje más fácil de NP metálicas, buena reproducibilidad, baja contaminación y excelente biocompatibilidad con anticuerpos y aptámeros27,28. Algunos tipos de GE utilizados para diagnosticar biosensores son: GE modificado con NP de oro para la detección de SARS-CoV-229, GE modificado con nanocompuesto de óxido de hierro/polipirrol/paladio para la detección de metotrexato y ácido fólico30, GE inmovilizado por anticuerpos para la detección de P5331 , GE modificado por fullereno (C60) para la detección de tumorigenicidad 232, y GE modificado por Fe3O4@ZIF-8 NP para la detección de sumatriptán33.

Los aptámeros poseen una amplia variedad de aplicaciones médicas en diferentes campos, incluidas soluciones terapéuticas, servicios de diagnóstico y biosensores34. Sus propiedades de reconocimiento están determinadas no sólo por sus secuencias específicas, sino también por su capacidad para plegarse en formas distintas con funciones específicas. Estas características sobresalientes convierten a los aptámeros en buenos candidatos para los agentes de biorreconocimiento de biosensores electroquímicos35,36.

En este estudio, explotamos una plataforma de detección de apta electroquímica y empleamos un procedimiento novedoso y eficiente para modificar la superficie de GE utilizando rGON y Rh-NP funcionalizados con aptámeros anti-HER2 para la detección y cuantificación del marcador oncomarcador HER2-ECD. Hasta donde sabemos, las Rh-NP no se han utilizado para la fabricación de biosensores, especialmente en el diagnóstico de marcadores cancerosos (Esquema 1).

Presentación esquemática del procedimiento de fabricación de aptasensor para detectar el marcador oncomar HER2-ECD: (1) la síntesis de rGON, (2) el proceso de formación de Rh-NP, (3) la inmovilización de hebras de aptámero y (4) el HER2- Detección de ECD utilizando el aptasensor propuesto.

Sintetizamos rGON en el GE mediante un método electroquímico in situ ecológico. Para producir múltiples capas de GON en la superficie de GE, se realizaron oxidación y exfoliación electroquímica durante cuatro barridos secuenciales en PBS (pH 6,5) a potenciales anódicos que oscilan entre 0,0 y + 3,0 V. Como se muestra en las curvas de voltamperometría cíclica (CV) en Fig. 1a, la oxidación electroquímica de la estructura de grafito se produjo durante el barrido positivo a aproximadamente + 1,4 V. Durante el proceso de oxidación electroquímica, las fuerzas de van der waals y otras fuerzas cohesivas en medio de las láminas de grafeno disminuyeron y las capas se separaron y espaciaron con la ayuda de la evolución de gas. Así, se produjo la intercalación y exfoliación de grafito a GON. Se produjeron compuestos intercalantes que comprenden un espectro diverso de grupos funcionales hidrofílicos oxigenados (es decir, hidroxilo, epoxi, carbonilo, ácido carboxílico), la mayoría de ellos situados en los bordes de los planos basales37,38. Se utilizó una exploración CV en potenciales catódicos que oscilan entre 0,0 y - 1,60 V durante cinco barridos secuenciales en PBS (pH 6,9) para reducir electroquímicamente los GON a rGON (Fig. 1b). La curva en el primer voltamograma cíclico de reducción electroquímica muestra una corriente máxima catódica amplia y significativa a aproximadamente − 1.350 V. Este pico significativo se debe muy probablemente a la reducción de grupos funcionales oxigenados en la superficie de GE modificada con GON. Esta reducción no puede relacionarse con la reducción de moléculas de H2O a hidrógeno porque ocurre con potenciales negativos mayores. En el segundo CV, el pico de corriente de reducción disminuye dramáticamente en potenciales negativos y casi desaparece después del segundo escaneo. Este hallazgo sugiere que se produce una disminución significativa en los grupos funcionales oxigenados en la superficie de los GON y se convierte en rGON de forma irreversible y rápida. Como resultado, los GON exfoliados se pueden reducir mediante un enfoque electroquímico a potenciales negativos39,40. En consecuencia, el número de ciclos voltamétricos, la velocidad de escaneo, el pH y la temperatura del electrolito de soporte se encontraban entre las características efectivas para convertir el grafito en rGON. Esta técnica fue más eficiente cuando se realizó a una velocidad de escaneo media (50 mV/s) y múltiples ciclos voltamétricos para proporcionar tiempo suficiente para la producción de rGON a partir de grafito en dos pasos de oxidación y reducción electroquímica. A un pH ligeramente ácido (6,5), las condiciones para el proceso de oxidación y la formación de GON fueron más favorables. Sin embargo, era mejor tener un pH ligeramente más alto (6,9) durante la reducción y conversión de GON en rGON, lo que reduce y elimina los grupos funcionales más fácil y rápidamente. Estos experimentos obtuvieron los mejores resultados a temperatura ambiente (20 a 24 °C).

(a) Curvas CV de síntesis de GON en GE durante cuatro barridos consecutivos en PBS (pH 6,5), (b) Curvas CV de síntesis de rGON en GE modificado con GON durante cinco barridos consecutivos en PBS (pH 6,9). Velocidad de escaneo: 50 mV/s.

Las nanopartículas de metales nobles (NMNP) se producen de manera eficiente reduciendo la sal metálica equivalente en agua41,42. Las Rh-NP se sintetizaron mediante reducción electroquímica. En este procedimiento, las Rh-NP se cultivaron en la superficie en condiciones óptimas aplicando la técnica CV en potenciales entre 0,0 y −800,0 mV durante cuatro barridos sucesivos43. Como resultado, el GE modificado con rGON se adornó con Rh-NP (Rh-NP/rGON/GE). Para la síntesis de NMNP, los rGON proporcionan numerosos sitios de nucleación. En consecuencia, se han desarrollado e investigado diferentes procedimientos para la síntesis de híbridos de grafeno con metales nobles como Au, Ag, Rh, Pd y Pt para el diseño de biosensores electroquímicos, catálisis, pilas de combustible, etc.44. La estructura 2D de las nanoláminas de grafeno en estos nanocompuestos híbridos no solo proporciona un marco perfecto para anclar las nanoestructuras metálicas, sino que también mejora la conductividad eléctrica y el transporte interfacial de electrones liberados por estas NP adherentes, limitando la agregación de nanopartículas45.

Para analizar los nanomateriales preparados se utilizaron microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM), espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS), mapeo EDS y espectroscopía de reflectancia total atenuada por infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR-ATR). Todos los resultados indicaron que los nanomateriales se sintetizaron con éxito.

Los grupos funcionales se identificaron mediante estudios espectroscópicos FTIR-ATR. Los espectros FTIR-ATR de grafito, GON y rGON se muestran en la Fig. 2. El pico característico a 1460 cm-1 corresponde a la vibración esquelética C = C del dominio grafito. Varios picos en el espectro de GON muestran grupos funcionales que contienen oxígeno. Los picos característicos de O – H (3391 cm −1), C = O (1732 cm −1), C – O (1556 cm −1), C – OH (1317 cm −1) y C – O (1162 cm-1) se cree que se asignan para estirar el grupo hidroxilo en el ácido carboxílico, el grupo carboxilo, el ácido carboxílico y el grupo carbonilo, respectivamente. La presencia de grupos funcionales de oxígeno en los espectros FTIR-ATR de GON indica que el grafito en escamas se ha oxidado a GON. Estos picos no aparecen en los espectros de grafito, lo que muestra la existencia de un número significativo de grupos funcionales de oxígeno (–COOH y C=O cerca del borde de la lámina, grupos –OH y C–O en epoxi en los planos basales de la lámina de GON) añadidos. durante el paso de oxidación. No hay ningún pico notable después de reducir y convertir GON en rGON, lo que indica que los rGON se reducen por completo. Los grupos funcionales carbono-oxígeno, como los grupos carboxilo, permanecen en la estructura de los rGON con picos débiles.

Espectros FTIR-ATR de electrodos de grafito (GE) no modificados, modificados con GON y modificados con rGON.

La Figura 3a, b muestra las imágenes FE-SEM de Rh-NP con morfología esférica extremadamente dispersa con tamaños a nanoescala que cubren rGON en la superficie del electrodo de grafito. La composición elemental de la superficie de Rh-NP / rGON / GE también se investigó mediante análisis de mapeo EDS, lo que muestra que la superficie del electrodo modificado está recubierta con Rh-NP (Fig. 3c). El perfil EDS de carbono, oxígeno y rodio (Rh) corrobora la formación exitosa de componentes de alta pureza (Fig. 3d).

( a, b ) Imágenes FE-SEM de Rh-NP / rGON / GE con tamaño nanométrico, ( c ) Análisis de mapeo EDS del elemento Rh en la superficie de GE modificado con rGON, ( d ) Análisis elemental EDS obtenido de Rh- NP/rGON/GE.

La espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS), la voltamperometría de pulso diferencial (DPV) y la CV son técnicas esenciales utilizadas en el desarrollo de biosensores y la evaluación de su desempeño46. Los CV de diferentes GE modificados se muestran en la Fig. 4a. La producción electroquímica de los GE modificados se compara con la del GE no modificado. La técnica CV se implementa ampliamente con fines exploratorios. El uso de esta técnica en el desarrollo de biosensores es común ya que la técnica CV posee información significativa como los tipos de procesos redox presentes en el análisis y la reversibilidad del proceso en las reacciones47. Los picos redox en el voltamograma cíclico correlacionados con la oxidación del ion ferrocianuro y la reducción del ion ferricianuro en la superficie GE se observan a 0,26 y 0,17 V, respectivamente. Las densidades de corriente máxima para los Rh-NP/rGON/GE son proporcionalmente más altas que las de los rGON/grafito y los GE desnudos. Esta amplificación de la señal electroquímica podría atribuirse a una mayor conductividad en presencia de Rh-NP y a un mayor transporte de masa por difusión del anión [Fe(CN)6]4− a la superficie de Rh-NP/rGON/GE en comparación con otros no modificados y GE modificados. Todas las caracterizaciones electroquímicas de Rh-NP/rGON/GE se llevaron a cabo en PBS que contenía ferri-/ferrocianuro de potasio 5,0 mM (+ KCl 0,1 M) como una solución de sonda electroquímica estándar.

(a) Voltamogramas cíclicos de diferentes GE modificados y no modificados, (b) Gráficos CV de Rh-NP/rGON/GE basados ​​en varias velocidades de escaneo de 5, 15, 30, 50, 100, 150, 200 y 400 mVs-1, (c) Curvas de calibración de las densidades de corriente máxima redox frente a la raíz cuadrada de la velocidad de barrido basadas en la caracterización del voltamograma cíclico de Rh-NP/rGON/GE, (d) curvas DPV de diferentes GE modificados y no modificados, (e) EIS Nyquist gráficos de diferentes GE modificados y no modificados en PBS que contienen redox de iones ferri-/ferrocianuro (1:1) 5,0 mM como sonda electroquímica, (f) diferentes concentraciones de aptasensor frente a densidades de corriente, g) tiempo de unión de incubación frente a densidades de corriente.

La Figura 4b demuestra las corrientes máximas en voltamograma cíclico para estados redox en presencia de una sonda electroquímica estándar a velocidades de escaneo de 5,0 a 400,0 mV/s. Como se puede ver en la Fig. 4c, existe una relación de linealidad entre la raíz cuadrada de la velocidad de escaneo y el redox de la densidad de corriente máxima. Cuando aumenta la velocidad de exploración, las densidades de corriente máxima anódica y catódica se elevan significativamente al mismo tiempo con un valor de coeficiente de correlación promedio (R2) de 0,990, lo que indica que la reacción redox está controlada por difusión48.

Los voltamogramas de pulso diferencial de GE modificados y no modificados se muestran en la Fig. 4d. Después de modificar el electrodo con rGON y Rh-NP, las densidades de corriente máxima aumentan significativamente. Los métodos electroquímicos basados ​​en técnicas de pulso como DPV son más sensibles que los métodos de barrido lineal debido a la posible minimización de la corriente capacitiva de interferencia. Las técnicas de pulso se emplean principalmente para la determinación cuantitativa, ya que DPV tiene un límite de detección significativamente más bajo que otras técnicas electroquímicas conocidas debido a una mayor relación señal-ruido.

EIS es una técnica de medición de resistencia eléctrica sensible y precisa que generalmente se emplea para la caracterización de superficies de electrodos modificadas o cambios significativos en las propiedades generales49. Las características de transferencia de electrones entre el electrolito y la superficie interfacial del electrodo se verificaron utilizando EIS en una solución de sonda electroquímica estándar. La resistencia de transferencia de carga (Rct) controla la cinética de la transferencia de electrones de la reacción redox iónica de ferri-/ferrocianuro de potasio en la interfaz electrolito-electrodo. Cuando el GE es modificado por rGON y Rh-NP (denominados Rh-NP/rGON/GE), exhibe un semicírculo en las frecuencias altas que incluye un pequeño valor Rct que es el resultado de una rápida transferencia de electrones50. Finalmente, entre los diferentes GE construidos con diversas modificaciones, se utilizó Rh-NPs/rGONs/GE como una plataforma óptima de aptasensor debido a su alto rendimiento en comparación con otros.

La estructura secundaria predicha de la cadena aptamérica anti-HER2 muestra que en su estructura primaria de bucle de vástago se encuentran bucles de vástago dobles y una secuencia aleatoria que se espera que se unan al lugar particular de HER2-ECD. La capa transductora es extremadamente importante para la inmovilización de la cadena de aptámero y la estabilización del cuádruplex G formado, lo que afecta la sensibilidad y selectividad del aptasensor. Parece que los nanomateriales son plataformas ideales para la inmovilización de hebras de aptámeros anti-HER2 debido a su biocompatibilidad privilegiada, así como a su relación superficie-volumen extremadamente grande51. La interacción entre HER2-ECD y la cadena aptamérica conduce a la apertura del dúplex en horquilla anti-HER2 y a la formación del complejo aptámero/HER2-ECD52. En este estudio se observó una disminución notable en las mediciones de corriente máxima de CV y ​​DPV en aptasensor. Esto se debe al hecho de que los aptámeros son compuestos aislantes en los que los grupos fosfato en sus estructuras se ionizarían en muchas cargas negativas en una solución acuosa que impiden la transferencia de electrones en la superficie del electrodo debido a la intensa repulsión electrostática con ferri-/ferro-. cianuro iónico redox disponible en sonda electroquímica53. La diferencia de densidad de corriente electroquímica obtenida al cambiar la concentración del marcador en comparación con la estabilización de BSA se utilizó como sistema de medición mostrado como Δj. Luego, se exploró el efecto de dos parámetros importantes, es decir, la concentración de aptámero anti-HER2 y el tiempo de unión de incubación para el marcador oncomarcador HER2-ECD. Primero, los MPA/Rh-NP/rGON/GE que ya habían sido activados por EDC/NHS se sumergieron en diferentes concentraciones de aptámero anti-HER2 (5, 15, 30, 50 y 100 nM), sumergidos en BSA al 5%. solución y se incuba con 300 ng/ml de HER2-ECD. Como se muestra claramente en la Fig. 4f, un aumento en la concentración de aptámero anti-HER2 hasta 50 nM mejora la densidad de corriente. Sin embargo, no se observa ningún cambio significativo para una concentración de aptámero superior a 50 nM ya que la superficie modificada del electrodo está completamente saturada con aptámero anti-HER254. En consecuencia, se seleccionó una concentración de aptámero anti-HER2 50 nM como concentración óptima. En segundo lugar, para obtener el mejor tiempo de unión de incubación del HER2-ECD, se incubó el aptasensor en una concentración de 300 ng/ml durante 10, 20, 40, 60, 90 y 120 minutos. La intensidad de la densidad de corriente (j) aumentó al aumentar el tiempo de unión de incubación y luego se mantuvo casi estable después de 40 minutos de incubación porque la superficie del electrodo estaba saturada. Por este motivo, se determinó que el tiempo de incubación más favorable era 40 min (Fig. 4g).

Dado que la cadena del aptámero anti-HER2 seleccionada estaba formada por 54 bases de oligonucleótidos (5′-(NH2-(CH2)6-GGG CCG TCG AAC ACG AGC ATG GTG CGT GGA CCT AGG ATG ACC TGA GTA CTG TCC)-3′) 51,55, fue fundamental optimizar la capa sensible para unir la hebra de aptámero a la superficie del GE modificado e inmovilizar el cuádruplex G generado. Dada su alta bioafinidad y biocompatibilidad intrínseca, los rGON y las Rh-NP podrían usarse como plataforma para inmovilizar cadenas de aptámeros anti-HER2, seguido del reconocimiento de HER2-ECD mediante la formación de cuádruplex G entre las cadenas de aptámeros y el marcador oncomarcador de HER2-ECD. . Como consecuencia, se empleó el aptasensor basado en BSA/Apt/MPA/Rh-NPs/rGONs/GE para evaluar cada etapa del procedimiento de detección de varios oncomarkers.

El aptasensor propuesto también se empleó para detectar el marcador oncomarcador HER2-ECD en varias dosis. Para ello, se analizó el marcador oncomarcador HER2-ECD en concentraciones que oscilaban entre 0,010 y 500,0 ng/ml. Luego, los resultados de la interacción se midieron utilizando la técnica DPV (Fig. 5a). Como se demuestra en la Fig. 5b, al aumentar la concentración de HER2-ECD, aumenta la densidad de corriente. La respuesta electroquímica del aptasensor hacia HER2-ECD está en el rango lineal de 10,0 a 500,0 ng/ml. La relación lineal entre Δj y Log [CHER2-ECD] fue: Δj (μA cm−2) = − 42,023 + 75,297 Log [CHER2-ECD] (ng/mL) y un R2 de 0,9937, donde [CHER2-ECD] es la concentración de HER2-ECD. El LOD y LOQ calculados con esta ecuación son 0,665 ng/ml y 2,01 ng/ml, respectivamente. Este aptasensor proporciona un rendimiento satisfactorio en comparación con los biosensores HER2-ECD actuales descritos en la literatura (Tabla 1). La estabilidad significativa del aptasensor se puede atribuir a BSA/MPA/Rh-NPs/rGONs/GE y a la fuerte unión covalente del aptámero anti-HER2 al electrodo modificado a través del conector MPA. Por lo tanto, los resultados demuestran un buen rendimiento del aptasensor incluso con concentraciones más bajas del marcador oncomarcador HER2-ECD que se pueden emplear para monitorear pequeños cambios en la concentración del marcador oncológico en muchas formas de cáncer durante la etapa primaria de la enfermedad. También se investigó la selectividad del aptasensor electroquímico utilizando diferentes agentes de interferencia, como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno prostático específico (PSA) y la albúmina sérica humana (HSA). Los resultados muestran que PSA y CEA tienen un ligero cambio en la densidad de corriente (Fig. 5c), mientras que el marcador oncomar HER2-ECD tiene un cambio significativo. Se fabricaron cuatro electrodos para evaluar la reproducibilidad (Fig. 5d). Estos hallazgos muestran que el aptasensor es extremadamente selectivo y estable para la detección directa del marcador oncomarcador HER2-ECD. La estabilidad a largo plazo es un parámetro importante en aplicaciones clínicas. Como se muestra en la Fig. 5e, los cambios de señal después de 14 días son mínimos y esto indica que el aptasensor ha mantenido su rendimiento de detección y estabilidad en comparación con el primer día con una desviación estándar relativa (RSD) del 4,3%. Por tanto, el aptasensor desarrollado tiene un alto nivel de fiabilidad y eficiencia.

(a) respuestas de DPV de aptasensor con diferentes concentraciones de HER2-ECD (0,01, 0,1, 1, 10, 15, 30, 50, 100, 200, 500 ng/ml); (b) Dependencia de la densidad de corriente de los cambios en la concentración de HER2-ECD (recuadro: la porción lineal de la curva de calibración); (c) Selectividad del aptasensor en contacto con marcadores oncomarcadores de HER2-ECD, CEA, PSA y HSA de 100 ng/ml; (d) Reproducibilidad del aptasensor para la detección de 100 ng/ml de HER2-ECD con 4 electrodos, por separado; (e) Estabilidad del aptasensor para la detección de 300 ng/ml de HER2-ECD en 14 días. Cada medición se repitió al menos 4 veces.

La aplicabilidad práctica del aptasensor introducido fue examinada y aprobada mediante análisis electroquímicos de marcadores oncológicos presentes en muestras de suero de pacientes. El aptasensor se empleó para la detección y cuantificación de HER2-ECD en muestras de suero de cinco pacientes. Los resultados (Tabla 2) coincidieron con los del kit ELISA disponible comercialmente. Por tanto, se puede deducir que el aptasensor propuesto es lo suficientemente fiable y sensible para su aplicación clínica.

En resumen, se construyó un aptasensor novedoso y bien organizado para la detección y determinación del marcador oncomarcador HER2-ECD. El efecto colaborativo de rGON y Rh-NP puede aumentar la señal electroquímica y la sensibilidad al aumentar la conductividad y el área de superficie específica. Además, la estabilidad del G-quadruplex formado aumentó a través de fuertes interacciones covalentes entre la cadena aptamérica y el marcador oncovalente. En consecuencia, se obtuvo un valor bajo de LOD igual a 0,667 ng/ml. Los resultados de este estudio confirmaron el desempeño exitoso del aptasensor construido. Este prometedor aptasensor electroquímico podría aplicarse de manera factible como plataforma para el diagnóstico y seguimiento de una amplia variedad de marcadores oncológicos en diferentes cánceres.

El lápiz de grafito tipo HB con un diámetro de 2,0 mm se adquirió de Rotring Co. Ltd, Alemania. Ácido 3-mercaptopropiónico (MPA), N-hidroxisuccinimida (NHS), albúmina sérica bovina (BSA), albúmina sérica humana (HSA), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), cloruro de rodio (III) (RhCl3, 98%) y el kit de ensayo ELISA HER2 (para suero, plasma, orina, etc.) se adquirió de Sigma-Aldrich, EE. UU. El ferricianuro de potasio (k3Fe(CN)6) y el ferrocianuro de potasio (K4Fe(CN)6) se obtuvieron de Merck, Alemania. El aptámero anti-HER2 se une específicamente al marcador oncomarcador HER2-ECD y se obtuvo de Bio Basic Inc, Canadá. La secuencia del aptámero de ADN HER2 terminado en amina (Apt) consta de bases de oligonucleótidos de 54 unidades es 5′-(NH2-(CH2)6-GGG CCG TCG AAC ACG AGC ATG GTG CGT GGA CCT AGG ATG ACC TGA GTA CTG TCC) -3′. Esta secuencia de aptámero de ADN anti-HER2 fue seleccionada mediante evolución en serie de ligandos in vitro mediante proceso de enriquecimiento exponencial (SELEX)51,55. El marcador oncomarcador HER2/ErBb2/CD340 humano recombinante se adquirió de Sigma-Aldrich, EE. UU. El ácido sulfúrico (H2SO4 98%), el ácido clorhídrico (HCl 37%) y el etanol (99,8%) se adquirieron en Merck, Alemania. Se obtuvieron otros reactivos de grado analítico del más alto nivel de pureza y todas las soluciones requeridas se prepararon a partir de agua bidestilada.

Todas las mediciones electroquímicas, incluidas CV, DPV y EIS, se llevaron a cabo utilizando un potenciostato-galvanostato Palmsense BV PGSTAT, con un voltaje de cumplimiento de 30 V (Echo chemie, Países Bajos) mediante una disposición habitual de celdas de tres electrodos. Como electrodo de trabajo se utilizó grafito con diversas modificaciones. La amplitud deseada de los potenciales se midió frente a Ag/AgCl en una solución que contenía KCl saturado, actuando como electrodo de referencia. Se utilizó un electrodo de alambre de platino que funcionó como contraelectrodo. Para cada experimento se utilizó un electrodo recién pulido y preparado. Las mediciones se realizaron exactamente después de aplicar los tres electrodos y sumergirlos en la solución de la sonda. Todos los experimentos electroquímicos se llevaron a cabo en PBS (0,1 M, pH 7,4) que contenía K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6] 5,0 mM (relación 1:1) y KCl 0,1 M como sonda de iones redox. pareja. El par redox iónico ferri-/ferrocianuro en medios tamponados se emplea frecuentemente como sonda estándar en estudios electroquímicos. El proceso redox iónico [Fe(CN)6]3−/4− implica una transferencia de un solo electrón y exhibe características cinéticas casi reversibles bajo la condición de que la transferencia de electrones en un ciclo completo sea menos resistente63.

Las curvas CV se registraron con una velocidad de exploración de 50 mV/s y dentro de -0,2 a +0,6 V frente a Ag/AgCl. La DPV se midió entre − 0,2 y + 0,6 V, con una amplitud de 50 mV y un ancho de pulso de 0,2 s. Las mediciones de EIS se llevaron a cabo en el rango de frecuencia de 0,01 a 50 kHz con un potencial directo de 0,22 V como potencial de polarización y una amplitud de 5,0 mV.

Utilizamos un enfoque electroquímico redox in situ simple, eficiente y novedoso para producir directamente GE modificados con rGON. Brevemente, se logró una voltamperometría cíclica (CV) que barrió el potencial de 0,0 a + 3,0 V durante una serie de cuatro barridos sucesivos en PBS (pH 6,5) para formar GON de pocas capas en la superficie del electrodo. Posteriormente, se realizaron barridos de CV de 0,0 a −1,60 V en PBS (pH 6,9) para la reducción electroquímica de GON exfoliados en cinco ciclos sucesivos para obtener rGON-GE39,64,65.

Las Rh-NP se sintetizaron electroquímicamente utilizando una solución electrolítica que contenía RhCl3 0,01 M y KCl 0,01 M. Se empleó la técnica CV en el rango de potencial de 0,0 a -800,0 mV durante cuatro barridos sucesivos. La solución de electrolito se proporcionó en agua bidestilada hasta un volumen final de 10 ml. La reducción catódica de iones rodio a temperatura ambiente ocurre de la siguiente manera:

Para preparar el electrodo utilizado en aptasensor, el GE modificado con Rh-NPs/rGONs se suspendió en una solución de MPA 20 mM disuelta en etanol/agua (3:1 V/V) a pH 6,8 con agitación (75 rpm) a temperatura ambiente. durante 18 h. Así, se enjuagó MPA/Rh-NPs/rGONs/GE con agua bidestilada. La concentración óptima de MPA se utilizó como conector para unir el electrodo modificado al agente de biorreconocimiento (aptámero anti-HER2). El MPA funcionalizado con carboxilo puede fortalecer la unión de hebras de aptámero funcionalizado con amino, así como mejorar la actividad electroquímica del aptasensor66. El MPA/Rh-NPs/rGONs/GE se incubó en PBS que contenía NHS 0,05 M y EDC 0,20 M durante 1 h a 8 °C para activar su superficie. Para la conjugación covalente de la superficie activada con el grupo amino (-NH2) del aptámero anti-HER2 funcionalizado, el electrodo modificado se sumergió en tampón PBS que contenía aptámero anti-HER2 50 nM a temperatura ambiente durante 1 h, para la formación del enlace amida. Además, Apt/MPA/Rh-NPs/rGONs/GE se sumergió en una solución de BSA con una concentración del 5% a una temperatura de 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5% y una humedad del 95% durante 5 minutos para bloquear los grupos funcionales carboxilo activados en la superficie del electrodo modificado que no está unido con los grupos funcionales amino del aptámero anti-HER2. El GE funcionalizado se enjuagó con PBS varias veces. Finalmente, el aptasensor construido se empleó para detectar diferentes marcadores oncológicos.

Se combinaron 8,0 g de NaCl, 200 mg de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 245 mg de KH2PO4 para preparar una solución tamponada con fosfato de 1,0 l (PBS, 0,1 M, pH 7,4). En el PBS mencionado anteriormente, se produjo una solución madre de aptámero (100 M), HER2-ECD, CEA, PSA y HSA y se mantuvo a 4 °C. Además, la solución se diluyó con PBS para lograr la concentración adecuada. Para el análisis en tiempo real, el suero humano se diluyó 20 veces con una solución de PBS 0,01 M (pH 7,4). Además, para la síntesis de rGON, el pH del PBS 0,1 M se ajustó con HCl 0,01 M.

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Descargar referencias

Los autores agradecen el apoyo financiero del Centro de Investigación de Administración de Nano Fármacos, Instituto de Tecnología de la Salud, Universidad de Ciencias Médicas de Kermanshah, Kermanshah, Irán (Subvención No. 990192; IR.KUMS.REC.1398.1245). También deseamos expresar nuestra más sincera gratitud al Dr. Keivan Majidzadeh-a y al Dr. Ramin Sarrami-Forooshani del BCRC, Motamed Cancer Institute, ACECR, Teherán, Irán, por su apoyo en instalaciones de laboratorio y muestras de suero reales.

Departamento de Nanobiotecnología, Facultad de Ciencia y Tecnología Innovadoras, Universidad Razi, Kermanshah, Irán

Mahdi Sadeghi y Soheila Kashanian

Facultad de Química, Centro de Investigación de Sensores y Biosensores (SBRC), Universidad Razi, Kermanshah, Irán

Soheila Kashanian

Centro de investigación de administración de nanofármacos, Instituto de Tecnología de la Salud, Universidad de Ciencias Médicas de Kermanshah, 6734667149, Kermanshah, Irán

Inspiración Arkan

Grupo de Investigación en Biomateriales e Ingeniería de Tejidos, Departamento de Tecnologías Interdisciplinarias, Centro de Investigación del Cáncer de Mama (BCRC), Instituto del Cáncer Motamed, ACECR, Teherán, Irán

Seyed Morteza Naghib

Departamento de Nanotecnología, Escuela de Tecnologías Avanzadas, Universidad de Ciencia y Tecnología de Irán (IUST), 1684613114, Teherán, Irán

Seyed Morteza Naghib

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MS estableció los procedimientos experimentales y escribió el borrador del manuscrito. SK, SMN y EA escribieron y revisaron el manuscrito y fueron supervisores.

Correspondencia a Soheila Kashanian, Seyed Morteza Naghib o Elham Arkan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Sadeghi, M., Kashanian, S., Naghib, SM et al. Un aptasensor electroquímico de alto rendimiento basado en nanopartículas de rodio decoradas con grafeno para detectar el marcador oncomar HER2-ECD en biopsia líquida. Informe científico 12, 3299 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07230-3

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Recibido: 15 de noviembre de 2021

Aceptado: 15 de febrero de 2022

Publicado: 28 de febrero de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-07230-3

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Nanotecnología del cáncer (2023)

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