Déficits duraderos en la memoria y patología neuronal después de la explosión

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 15075 (2015) Citar este artículo

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Pocos estudios preclínicos han evaluado la neuropatología y los déficits de comportamiento a largo plazo después de sufrir un neurotrauma inducido por explosión (BINT). Estudios anteriores han demostrado astrogliosis extensa y muerte celular en etapas agudas (<7 días), pero aún no se ha determinado la respuesta temporal en una etapa crónica. Aquí, utilizamos ensayos de comportamiento, inmunohistoquímica y neuroquímica en áreas límbicas como la amígdala (Amy), el hipocampo (Hipp), el núcleo accumbens (Nac) y la corteza prefrontal (PFC), para determinar los efectos a largo plazo de una sola exposición a una explosión. . Los resultados de comportamiento identificaron un comportamiento de evitación elevado y una disminución de la memoria a corto plazo uno o tres meses después de una sola explosión. Tres meses después de BINT, los marcadores de neurodegeneración (FJB) y activación de microglía (Iba-1) aumentaron, mientras que el índice de neuronas maduras (NeuN) disminuyó significativamente en todas las regiones del cerebro examinadas. La gliosis (GFAP) aumentó en todas las regiones excepto Nac, pero solo la PFC fue positiva para la apoptosis (caspasa-3). A los tres meses, la tau se elevó selectivamente en PFC y Hipp, mientras que la α-sinucleína aumentó transitoriamente en Hipp un mes después de la exposición a la explosión. La medida neuroquímica compuesta, mioinositol + glicina/creatina, aumentó consistentemente en cada región del cerebro tres meses después de la explosión. En general, una sola explosión tuvo efectos duraderos a largo plazo sobre el comportamiento y secuelas neuropatológicas.

El neurotrauma inducido por explosión (BINT) es una condición debilitante que a menudo afecta la cognición. En los últimos años, la prevalencia de BINT ha aumentado debido a los conflictos militares. En los EE. UU., a medida que las tropas regresan del combate, ha aumentado la prevalencia de soldados con exposición a explosiones que se correlaciona con déficits psicológicos y psiquiátricos1,2. La exposición a la onda expansiva primaria puede no mostrar signos de diagnóstico visibles de lesión, pero puede causar daño neurológico significativo. El estrés oxidativo se ha asociado comúnmente con BINT como un factor crítico que afecta la función mitocondrial y la disfunción en el metabolismo de la glucosa3,4,5,6. Además, los estudios han demostrado que una regulación alterada del metabolismo de la glucosa puede provocar una disfunción del ciclo de Krebs y una disminución de la producción de ATP, lo que provoca malestar celular3,7,8. Además, investigaciones anteriores han demostrado una alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) y un aumento de los marcadores inflamatorios, como el interferón (IFN)-γ, la interleucina-1β (IL-1β) y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), después de BINT3,4,5 ,7. La presencia de neuroinflamación se ha visto respaldada además por un aumento de los marcadores de recambio de membrana, como la glicerofosfocolina (GPC) y la fosforiletanolamina (PEA), que conducen a la apoptosis en el hipocampo3. También se ha demostrado que los sistemas colinérgico, dopaminérgico y serotoninérgico se ven afectados después de BINT6,9. Esto podría alterar drásticamente las cascadas de señalización, provocando apoptosis y alteración de la comunicación neuronal en diferentes regiones del cerebro.

Se ha informado que regiones del cerebro, como la amígdala, el cerebelo, el hipocampo, el núcleo accumbens y la corteza prefrontal, muestran niveles elevados de apoptosis en las etapas aguda a subaguda después de BINT3,4,5,8,10,11, 12. La mayoría de los informes han mostrado una pérdida de poblaciones neuronales, al mismo tiempo que muestran un aumento de la astrogliosis3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. El número limitado de estudios de resonancia magnética combinados con datos histopatológicos han demostrado la vulnerabilidad de los oligodendrocitos y las células endoteliales después de BINT13,14,15. Junto con los cambios moleculares, en estudios preclínicos agudos se han demostrado ampliamente anomalías del comportamiento como el deterioro de la memoria y la ansiedad11,16,17. Estos cambios se alinean con la presentación de síntomas clínicos después de BINT. Aunque la respuesta de BINT se ha examinado en etapas agudas (<5 días), el mecanismo de progresión de la lesión celular y los marcadores biológicos no se comprenden completamente para explicar el retraso en el diagnóstico clínico del neurotrauma3,4. Además, se han estudiado poco las regiones del cerebro que desempeñan funciones importantes en el estrés emocional y el condicionamiento del miedo, como la amígdala y el núcleo accumbens. Existen pocos informes sobre la patología de la amígdala y el núcleo accumbens9,16,17. Además, la falta de comprensión profunda sobre la patología de la corteza prefrontal podría limitar aún más el conocimiento sobre la pérdida de memoria debido a BINT. Las conexiones entre BINT y el trastorno de estrés postraumático (TEPT) se han establecido en el contexto de hitos clínicos18. Se ha demostrado que BINT provoca una manifestación de síntomas clínicos como pérdida de memoria y aprendizaje a corto plazo19,20. Pocos informes preclínicos han sugerido que BINT pueda conducir a una regulación positiva de los marcadores asociados a la demencia7,12. Es fundamental reconocer el papel de los marcadores bioquímicos como las proteínas tau y priónicas, que están asociadas con la demencia, en el hipocampo y la corteza prefrontal para comprender los fundamentos patológicos de BINT7,12. Además, comprender las consecuencias a largo plazo de BINT en la amígdala, el hipocampo, el núcleo accumbens y la corteza prefrontal podría abrir una ventana para intervenciones terapéuticas y diagnósticos.

Caracterizar la progresión temporal de BINT es importante para estudiar los síntomas de desarrollo lento que pueden usarse para el pronóstico de los veteranos militares que no presentan signos agudos de esta afección19. El estudio de los efectos crónicos en un modelo experimental de BINT permite descubrir más sobre el efecto retardado en las cascadas de lesiones celulares. Se ha demostrado que existen déficits en el aprendizaje y la memoria dependientes del hipocampo al mes en un modelo de ratón; sin embargo, otras regiones del cerebro que son vitales para el aprendizaje y la memoria están poco estudiadas20.

Se han desarrollado estudios para examinar cómo eventos traumatizantes, como la exposición a ondas explosivas, pueden contribuir a alteraciones en la función de la memoria y angustia emocional3,14,16. Por tanto, la hipótesis de este estudio es que BINT induce alteraciones en la neuroquímica y la neuropatología agudas que crean un comportamiento y una neuropatología aberrantes crónicos. De acuerdo con la hipótesis, estudios anteriores han encontrado niveles elevados de mioinositol + glicina (Ins + Gly)/creatina (Cre), Iba-1 y GFAP, marcadores de gliosis, en roedores con deterioro de la memoria11. Además, la neurodegeneración fue respaldada por la evidencia de un aumento de Fluoro-Jade B y una disminución de los niveles de NeuN mediante inmunohistoquímica.

Se pueden observar más vínculos entre BINT y la demencia/enfermedad similar a Alzheimer al encontrar cambios en la neuropatología relacionados con la pérdida de memoria espacial y a corto plazo. En conjunto, este estudio establece BINT como un factor de riesgo de demencia con evidencia patológica y conductual que lo respalda. Una exposición a una explosión podría provocar una pérdida duradera de memoria, ansiedad y la patología que la acompaña. Además, los cambios que ocurren en un momento temprano podrían usarse para predecir cambios patológicos a largo plazo después de la exposición a una explosión.

Se ha demostrado que la neuropatología dentro de la región amígdala debido a una lesión cerebral induce ansiedad o evitación en animales. Así, se han utilizado pruebas de caja clara y oscura para estudiar cambios de comportamiento debidos a patología amígdala. En comparación con la actividad de los controles (Fig. 1A), los animales expuestos previamente a la explosión ingresaron rápidamente a la cámara oscura al ser introducidos en el aparato (es decir, exhibieron una latencia disminuida para ingresar al lado oscuro, p <0,05); sin embargo, no hubo ningún efecto general de la exposición a la explosión en el número de transiciones o el tiempo total pasado en cámaras oscuras o luminosas.

(A) Los animales explosivos evitaron activamente la cámara de luz, como lo demuestra la disminución significativa del tiempo de latencia para la entrada inicial a la cámara oscura (*p <0,05). (B) La disminución del tiempo dedicado al objeto novedoso sugirió una interrupción a largo plazo del aprendizaje y la memoria en el grupo explosivo (*p < 0,05). En cada caso, a la respuesta del grupo de control se le asignó el 100% y la respuesta de los grupos de explosión se escaló en consecuencia.

Se ha demostrado que las lesiones primarias por explosión afectan la memoria en estudios tanto clínicos como preclínicos, siendo el hipocampo y la corteza prefrontal las principales regiones efectoras. La recuperación y codificación de la memoria se maneja mediante la neurotransmisión entre la corteza prefrontal y el hipocampo. En comparación con el mayor tiempo que los animales de control pasaron con un objeto novedoso en la fase T2 de la prueba, los animales expuestos a la explosión (tanto al mes como al 3, p <0,05) pasaron significativamente menos tiempo con el objeto novedoso (Fig. 1B). La disminución del tiempo con un objeto nuevo en estas condiciones experimentales es consistente con déficits en el aprendizaje y/o en los procesos de recuperación de la memoria a corto plazo.

Los neuroquímicos podrían usarse como predictores de lesión cerebral en términos de estado energético, inflamación, estrés oxidativo y neurotransmisión. Esta información se puede traducir directamente ya que 1H-MRS se puede utilizar clínicamente. Junto con la inmunohistoquímica, se podrían comprender mecanismos patológicos más detallados en relación con los déficits de conducta.

Un mes después de la exposición a la explosión, hubo un aumento significativo en las concentraciones absolutas de glutamato (Glu) (2,84 ± 0,11 nmol/mg frente a 3,98 ± 0,56 nmol/mg) y colinas (suma de glicerofosfocolina (GPC), colina (Cho), fosfocolina (PCH)) (0,60 ± 0,11 nmol/mg vs 1,19 ± 0,26 nmol/mg) y una disminución en la relación ácido γ-aminobutírico (GABA)/creatina (Cre) (1,48 ± 0,18 vs 0,96 ± 0,12) y la relación GABA/Glu (0,80 ± 0,14 vs 0,49 ± 0,06) (p < 0,05). Tres meses después de la exposición a la explosión, hubo un aumento significativo en las concentraciones absolutas de mioinositol (Ins) (2,41 ± 0,41 nmol/mg frente a 3,58 ± 0,22 nmol/mg) y en la proporción de Ins + glicina (Gly)/Cre ( 2,04 ± 0,18 frente a 3,27 ± 0,53) (p < 0,05).

Un mes después de la exposición a la explosión, se observó un aumento significativo en las concentraciones absolutas de Cho (0,14 ± 0,01 nmol/mg frente a 0,31 ± 0,08 nmol/mg). Tres meses después de la exposición a la explosión, se observó un aumento significativo en la proporción de lactato (Lac)/Cre (2,21 ± 0,10 frente a 2,63 ± 0,08), un aumento en la proporción de Ins-Gly/Cre (1,65 ± 0,48 frente a 2,89 ± 0,21) y se observó una disminución en la relación glutamina (Gln)/Glu (0,58 ± 0,07 0,41 ± 0,03) (p < 0,05).

Un mes después de la exposición a la explosión, hubo un aumento significativo en las concentraciones absolutas de fosforiletanolamina (guisante) (0,75 ± 0,12 nmol/mg frente a 1,11 ± 0,07 nmol/mg) (p < 0,05). Tres meses después de la exposición a la explosión, se encontró un aumento significativo en las proporciones de Glu/Cre (1,68 ± 0,05 frente a 1,84 ± 0,03), Ins/Cre (1,89 ± 0,17 frente a 2,39 ± 0,07) e Ins-Gly/Cre (2,56 ± 0,34 frente a 3,57 ± 030) (p < 0,05).

Un mes después de la exposición a la explosión, se observó un aumento significativo en las concentraciones absolutas de Glu (2,64 ± 0,41 nmol/mg frente a 4,15 + 0,61 nmol/mg), Cho (0,06 ± 0,01 nmol/mg frente a 0,13 ± 0,03 nmol/mg), Ins ( 1,29 ± 0,30 nmol/mg vs 2,26 + 0,33 nmol/mg), Ins-Gly (0,73 ± 0,31 nmol/mg vs 2,20 + 0,40 nmol/mg) y la relación de Gln/Cre (0,49 ± 0,02 vs 0,57 ± 0,02) ( p < 0,05). Tres meses después de la exposición a la explosión, se observó una disminución significativa en las concentraciones absolutas de n-acetil aspartato (NAA) (3,26 ± 0,18 nmol/mg frente a 2,41 ± 0,27 nmol/mg) y colinas (1,02 ± 0,11 nmol/mg frente a 0,41 ± 0,16). nmol/mg) y se observó un aumento en la relación Ins-Gly/Cre (1,54 ± 0,17 vs 2,56 ± 0,70) (p < 0,05).

Se evaluaron marcadores de astrogliosis, muerte celular y neurodegeneración. En la Tabla 1 se presenta un resumen de todos los datos brutos.

Astrogliosis: Se observó un aumento significativo en la astrogliosis con niveles elevados de GFAP en el grupo de explosión en comparación con el control. Específicamente, se encontró un aumento de GFAP en las regiones Amy, Hipp y PFC, pero no en la región Nac al mes y a los tres meses. Los niveles de Iba-1 aumentaron significativamente en las regiones Amy, Hipp, Nac y PFC al mes y a los tres meses en el grupo de explosión en comparación con el control (p <0,05) (Fig. 2).

Paneles izquierdos: Se observó un aumento de astrogliosis (GFAP+) (*p < 0,05) en Hipp (A1), Amy (B1) y PFC (C1), pero no se observaron cambios en Nac (D1) cuando se comparó el grupo de blastos con el grupo de control. 1 y 3 meses después de la exposición. Imágenes inmunoquímicas representativas de GFAP en el área de control (E1) del giro dentado (DG) y el grupo de explosión (F1). Paneles derechos: Se observó un aumento de microglía (Iba-1) (*p < 0,05) en Hipp (A2), Amy (B2), PFC (C2) y Nac (D2) cuando se comparó el grupo de blastos con los controles al mes 1 y 3. siguiente exposición. Se muestran imágenes de inmunohistoquímica representativas para Iba-1 en el DG de control (E2) y grupos explosivos (F2).

Muerte celular: se observó un aumento significativo en caspasa-3 en PFC pero no en Amy, Hipp o Nac al mes y a los tres meses en blast en comparación con el grupo de control (p <0,05) (Fig. 2).

Neurodegeneración y pérdida neuronal: el aumento de la inmunorreactividad de FJB sugirió neurodegeneración en Amy y PFC en ambos momentos después de la explosión, mientras que Hipp y Nac mostraron degeneración solo a los tres meses (Fig. 3). El factor de transcripción neuronal específico NeuN disminuyó en Amy, Nac y PFC en ambos momentos, mientras que el NeuN del hipocampo disminuyó solo tres meses después de la explosión. (p < 0,05) (Figura 3). Se observó un aumento de alfa-sinucleína en la región CA3 de Hipp un mes después de la explosión, pero no se observaron cambios en otras regiones de Amy, Hipp o PFC al mes y a los tres meses (datos no mostrados). Se observaron aumentos en la agregación de la proteína tau en Hipp y PFC tres meses después de la exposición a la explosión, pero no en Amy o Nac (Fig. 4).

Paneles superiores: Sólo el PFC (C1) mostró signos de actividad apoptótica en el período prolongado posterior a la explosión.

No se observaron aumentos significativos en caspasa-3 en Hipp (A1), Amy (B1) o Nac (D1) en comparación con los controles al mes. Imágenes de inmunohistoquímica representativas para caspasa-3 en PFC de los grupos control (E1) y blast (F1). Paneles inferiores: Se observó un aumento de la neurodegeneración (neuronas FJB+) en todas las regiones a los 3 meses, mientras que solo Amy (B2) y PFC (C2) mostraron degeneración al mes (*p < 0,05). Se muestran imágenes de inmunohistoquímica representativas para Fluoro-Jade B en CA3 de Hipp de los grupos control (E2) y blast (F2).

Paneles superiores: la tinción para NeuN, una proteína que se encuentra exclusivamente en neuronas maduras, disminuyó en Amy (B1), Hipp (A1), Nac (D1) y PFC (C1) de animales explosivos (*p < 0,05). Se muestra la tinción inmunoquímica representativa para NeuN (rojo) en el DG de control (E1) y grupos blastos (F1). Paneles inferiores: se observó un aumento de la patología tau en Hipp (A2) y PFC (B2) obtenidos tres meses después de la explosión, en comparación con el grupo de control (*p < 0,05). Se muestra la tinción inmunoquímica representativa para tau (verde) en DG de animales de control (C2) y del grupo blast a los 3 meses (D2).

Se han identificado numerosos resultados patológicos en relación con BINT. Se ha identificado que las alteraciones/desequilibrio neuroquímicos, el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la alteración de la BHE son eventos patológicos importantes que están involucrados en las etapas agudas después de BINT3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. 14,15,21,22,23. Sin embargo, los efectos a largo plazo sobre diversos marcadores patológicos y los déficits cognitivos asociados no están claros actualmente. Evaluar los subcampos de todas las regiones es un objetivo futuro importante para comprender mejor cómo los subcampos contribuyen a la patología observada de BINT. En estudios previos, se observó que los cambios agudos (3 a 48 horas) en la neuroquímica estaban asociados principalmente con el estrés oxidativo (niveles reducidos de glutatión o superóxido dismustasa 1 (SOD1)) en las regiones Hipp, Nac y PFC después de BINT3,9,11. Se sabe que el estrés oxidativo inicia vías de lesión celular que eventualmente causan la muerte celular. Este proceso se desencadena principalmente por una falla mitocondrial que conduce a un metabolismo energético comprometido, inflamación debido a la ruptura de la membrana celular y homeostasis celular irregular causada por el agotamiento de la energía24.

El estrés oxidativo actúa directamente sobre los procesos mitocondriales que se unen a NAD/NADPH disminuyendo la producción de ATP necesario para la homeostasis celular24,25. Este entorno dañino crea estrés celular que podría traducirse en redes de señalización deterioradas que conduzcan a patología a largo plazo. En este estudio, se observó que las regiones cognitivas primarias del cerebro (Amy, Hipp, Nac y PFC) tenían una pérdida sustancial de neuronas y una elevación de astrocitos activados. Los problemas crónicos de la memoria de trabajo y el comportamiento asociado a la ansiedad se relacionaron con la activación crónica de los astrocitos en Hipp y la microglía en Amy, respectivamente.

Aunque los estudios agudos muestran una alteración del nivel de energía que conduce a la muerte celular, un estudio subagudo del PFC ha demostrado una relación directa entre los niveles de Ins y el deterioro de la memoria a corto plazo después de la exposición a BINT18. Según este estudio, los niveles elevados de Ins + Gly podrían representar la progresión del deterioro de la memoria en asociación con la astrogliosis. Los datos subagudos (3 a 7 días) muestran un estrés metabólico continuo por el aumento de las proporciones de Glu/Gly o GABA/Glu. Sin embargo, la conversión de estos metabolitos ocurre en los astrocitos como una cascada de apoyo para las neuronas glutaminérgicas o GABAérgicas en el cerebro26,27,28. Esto respalda la idea de que otras poblaciones celulares, como los oligodendrocitos y otras células gliales, podrían ser más sensibles a la exposición a explosiones, pero esta hipótesis necesita más evaluación. En Amy, Hipp y PFC se han confirmado niveles elevados de colina, un marcador de inflamación, mediante el recambio de la membrana celular3,29. Alternativamente, esto podría ser representativo de un desequilibrio en el sistema colinérgico y la falta de control homeostático podría resultar en una elevación de los niveles de colina en estas regiones. Además, los niveles elevados de glutamato podrían ser un factor que contribuya a la excitotoxicidad. La evidencia de una disminución de los niveles de NAA también podría estar asociada con un aumento de los niveles de glutamato, ya que la NAA amortigua los niveles de glutamato para formar NAAG30. Sin embargo, el aumento de NAAG y la disminución general de NAA podrían ser un indicador de una disminución de la población neuronal en PFC. Además, los cambios en GABA/Glu y Gln/Glu en Amy y Hipp, respectivamente, mostraron una neurotransmisión glutamérica alterada. La neurotransmisión glutamatérgica desempeña un papel fundamental en la formación de la memoria y los trastornos del estado de ánimo31. Esta evidencia fue respaldada aún más por los cambios en los niveles de Glu en Nac y PFC.

Curiosamente, se encontraron niveles elevados de Ins + Gly, un marcador de astrogliosis, en todas las regiones en una etapa crónica de tres meses después de la explosión11,32. Se ha establecido que el Ins es un marcador de astrocitos y la glicina está regulada positivamente en los astrocitos debido a la degradación del Glu11,26,27,28. Por tanto, la combinación de Ins + Gly puede relacionarse específicamente con la astrogliosis reactiva. Clínicamente, el aumento de Ins + Gly se está utilizando para clasificar los astrocitomas en estudios de gliomas, lo que fortalece el Ins + Gly como marcador de astrocitos reactivos26,32. La proporción de Ins + Gly/Cre sugiere que la creatina, un compuesto abundante en el cerebro, podría permanecer inalterada, posiblemente debido a que los pequeños cambios podrían ser difíciles de identificar mediante MRS.

Los estudios clínicos han demostrado niveles elevados de Gly en la patología de la demencia y la enfermedad de Alzheimer (EA) utilizando 1HMRS. La relación Ins/Cre elevada se ha asociado con la carga de β-amiloide mediante tomografía por emisión de positrones (PET) en ancianos con cognición normal y típicamente está elevada en el deterioro cognitivo leve y la demencia por EA33,34. Por tanto, Ins + Gly podría ser un marcador para identificar el pronóstico de deterioro cognitivo leve tras la exposición a una explosión34,35.

Según se informa, los déficits de conducta se deben a las secuelas patológicas de cambios neuroquímicos, apoptosis y astrogliosis3,9,11. Varios trastornos psiquiátricos y psicológicos se presentan con cambios neuroquímicos y patología específica después de lesiones cerebrales (LCT, accidente cerebrovascular)33,34. Los estudios preclínicos y clínicos han demostrado déficits cognitivos persistentes y ansiedad después de la exposición a explosiones5,11,16,17,36. Como tal, se evaluaron estos resultados conductuales. El aumento de la ansiedad puede deberse a una patología de las células que conduce a la neurodegeneración debido a un entorno biológicamente estresado continuo. Se observó que el estrés biológico era consistente en Nac con una pérdida de neuronas y estrés oxidativo intracelular que resultaba en astrogliosis.

La evidencia de pérdida neuronal fue respaldada por un aumento de la neurodegeneración y la pérdida de neuronas encontrada al mes y a los tres meses. Los datos sugirieron que la pérdida neuronal conduce a un marcado aumento de astrogliosis en Amy, Hipp, Nac y PFC. Se encontró que todas las regiones evaluadas tenían una pérdida aguda de neuronas según la literatura anterior3,9,21,37. Esta pérdida de neuronas se mantuvo durante el período de evaluación de tres meses. La cantidad de población neuronal que disminuyó fue similar en todas las regiones. Además, un aumento en la agregación de la proteína tau sugirió que los ovillos de tau podrían ser un factor que contribuye a la neurodegeneración debido a su toxicidad. Informes anteriores de Huber et al. (2013) y Kochanek et al. (2013) respaldan la evidencia de demencia (especialmente demencia vascular) y han mostrado un aumento de tau y ovillos de tau fosforilada hasta un mes después de la exposición a una explosión7,12.

Un aumento de microglia, evaluado con Iba-1, sugirió que los niveles de microglia están aumentando en número para ayudar con el proceso de reparación de lesiones. Además del papel de la microglía en el proceso inflamatorio, se encontraron aumentos de colina o cambios en la betaína, el precursor de la colina, al mes o tres meses en las cuatro regiones del cerebro que estaban bajo investigación, lo que significa que hay inflamación en curso38,39. Los niveles de α-sinucleína, una proteína presináptica importante para el reciclaje de vesículas, aumentaron significativamente en la región CA3 de Hipp y la proteína estructural de microtúbulos tau aumentó en Hipp y PFC. En conjunto, los resultados de la evaluación neuroquímica demostraron aumentos de Ins + Gly y Glu/Gly que respaldan la evidencia de astrogliosis. Estos resultados biológicos parecen estar asociados con los déficits de comportamiento en el aprendizaje, la memoria y la evitación activa después de BINT.

Con el avance de la tecnología, la MRS (o NMR) clínica podría resolver los picos de Glu, GABA, Lac, Cre, Ins, colinas y NAA. La RMN se puede utilizar como herramienta de diagnóstico fundamental y medida de la eficacia del tratamiento en BINT para comprender los cambios en las regiones cognitivas esenciales como Amy, Hipp, Nac y PFC. Sin embargo, el uso de la RMN para la neurociencia se encuentra en una etapa incipiente como herramienta de diagnóstico. Comprender los perfiles metabólicos clínicamente proporcionaría información sobre los cambios potenciales que pueden estar relacionados con estudios en animales que identifican cambios metabólicos clave, así como para la identificación de biomarcadores clave.

Todos los experimentos están de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Tech y todos los protocolos experimentales descritos en este documento han sido aprobados. Antes de todos los experimentos, se aclimataron ratas Sprague Dawley macho (~ 250 g, Harlan Labs, San Diego) a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con comida y agua proporcionadas ad lib. Como se describió anteriormente, el frente de choque y la sobrepresión dinámica se generaron usando un Simulador de Explosión Avanzado (ABS) hecho a medida (200 cm × 30,48 cm × 30,48 cm) que consiste en una cámara de compresión motriz unida a una transición rectangular y una cámara de prueba con un eliminador de onda final (ORA Inc. Fredericksburg, VA) ubicado en el Centro de Biomecánica de Lesiones de la Universidad Tecnológica de Virginia. Se instaló un eliminador pasivo de ondas finales (EWE) en el extremo de ventilación del ABS, que minimiza la salida de ondas de choque mediante un sistema de placas especialmente diseñado. Los patrones en el sistema de placas EWE se crearon para reflejar los impactos reflejados y las rarefacciones, que tienden a "cancelarse" entre sí y disminuir los efectos no deseados dentro de la sección de prueba. Se produjo una sobrepresión estática máxima con helio comprimido y láminas de acetato calibradas (Grafix Plastics, Cleveland, OH)36,40.

Las mediciones de presión se recolectaron a 250 kHz utilizando un sistema de adquisición de datos Dash 8HF (Astro-Med, Inc, West Warwick, RI) y las sobrepresiones máximas se calcularon determinando la velocidad de la onda (m/s) en la posición de la muestra. Se usó un cabestrillo de malla para sujetar al animal durante la exposición, lo que permitió un obstáculo mínimo de la onda a través de la cámara y se verificaron los perfiles de las ondas de choque para mantener presiones de exposición consistentes entre los sujetos. Los animales fueron anestesiados con isoflurano al 3% antes de colocarlos en orientación cefálica rostral hacia la onda de choque. La exposición de todo el cuerpo se considera "en el eje" con el animal mirando en orientación cefálica rostral hacia la explosión. Esta exposición tiene un efecto mínimo en los pulmones de los animales, ya que el impacto se transmite por todo el cuerpo. Por lo tanto, la exposición resultante en este estudio crea una lesión cerebral relativamente específica y un trauma poliorgánico mínimo. Los animales se separaron aleatoriamente en cuatro grupos según puntos temporales (n = 12/grupo). Dos grupos fueron sacrificados un mes después de la explosión o del control. Los dos grupos adicionales fueron sacrificados tres meses después de la explosión o el control. Los grupos de explosiones fueron expuestos a un único perfil de presión incidente que se asemeja a una exposición a una explosión en "campo libre", con una única forma de onda tipo Friedlander, que se encuentra en un rango leve a moderado a 17 psi (117 kPa) con una duración positiva de 2,5 ms, mientras que los Los grupos de control se sometieron a los mismos procedimientos con la excepción de la exposición a explosiones36,40. Las condiciones de vivienda durante la recuperación fueron idénticas a las del pretratamiento y similares para todos los grupos experimentales. De cada grupo experimental de N = 12/grupo para pruebas de comportamiento, seis fueron asignados aleatoriamente a evaluaciones neuroquímicas ex vivo (N = 6/grupo) y seis para análisis inmunohistoquímicos (N = 6/grupo).

Los animales fueron evaluados para detectar déficits de comportamiento uno y tres meses después de la explosión. La actividad locomotora en la caja de luz/oscuridad (L/D) es una medida etológica sensible a las benzodiazepinas del conflicto entre la motivación inherente para explorar un entorno nuevo y el miedo-evitación de un peligro percibido en la luz36,41,46. En el presente experimento, utilizamos el tiempo inicial para ingresar al lado oscuro como un índice del nivel de estado de ansiedad y consideramos una latencia disminuida (desde el inicio del experimento) para ingresar a la oscuridad como un fenotipo conductual de evitación similar a la ansiedad mejorada. . El aparato constaba de dos compartimentos acrílicos, un lado oscuro cerrado con una tapa y un lado luminoso. Las medidas de la caja L/D son 72 × 30,5 × 33,5 cm siendo el lado oscuro igual a 35,5 × 30,5 × 33,5 cm y el lado claro 35,5 × 30,5 × 33,5 cm. Cada rata fue probada colocándola en el área iluminada de espaldas al compartimento oscuro y se le permitió explorar el nuevo entorno durante cinco minutos. Para minimizar el sesgo ambiental, el animal se dejó solo en la sala de pruebas durante el tiempo exploratorio y las mediciones de comportamiento. La latencia desde el inicio del experimento hasta el ingreso a la cámara oscura, las transiciones claro-oscuro y el tiempo transcurrido en el lado luminoso se midieron con el software de seguimiento de video Ethovision™ (Noldus Information Technology, Leesburg, VA), como se informó anteriormente36. Se utilizó la posición de todo el cuerpo para determinar las transiciones de los compartimentos en términos de calcular el tiempo pasado en el compartimento de luz, las transiciones y la latencia inicial.

La prueba NOR se utilizó para medir la memoria a corto plazo, específicamente el reconocimiento de objetos (5). Los animales fueron evaluados uno o tres meses después de la exposición a la explosión. Las pruebas se realizaron en tres fases que incluyen: aclimatación = aclimatación a un entorno nuevo, prueba 1 (T1) = presentación de dos objetos similares y prueba 2 (T2) = presentación de un objeto nuevo y familiar. En la primera fase, las ratas se aclimataron a una cámara de prueba de campo abierto hecha a medida (79 × 79 × 35 cm) con iluminación tenue, permitiéndoles explorar la cámara vacía durante cinco minutos (tiempo utilizado en todas las fases) durante dos días consecutivos. antes de realizar la prueba como se describió anteriormente5,11. La cámara de pruebas estaba ubicada en una habitación cerrada y el comportamiento se registró digitalmente con una cámara ubicada encima de la cámara y conectada a una computadora fuera de la habitación. Después de colocar un animal en la cámara, el experimentador salió de la habitación y observó al animal en la computadora conectada a la cámara. Un evaluador ciego a las condiciones del tratamiento verificó el seguimiento y la puntuación automatizados. La cámara de prueba se limpió con etanol al 70% en agua entre cada uso5,11.

Fracción de tiempo pasado en una posición nueva = Tiempo que el animal pasó en la ubicación del objeto nuevo/(Tiempo pasado en la ubicación del objeto nuevo ± ubicación del objeto familiar).

El análisis 1H-MRS se realizó como se describió anteriormente utilizando una técnica HRMAS modificada en un campo magnético de 11,7 T3,9,11. Una vez completadas las evaluaciones de comportamiento, se practicó la eutanasia a los animales (N = 6/grupo), se extirparon los cerebros, se colocaron en una matriz cerebral enfriada y luego se cortaron en rodajas coronales de 2 mm. Las rebanadas se congelaron inmediatamente en CO2 sólido y luego se tomaron punzones contralaterales de 1,5 mm de diámetro de Amy, Hipp, Nac y PFC de acuerdo con el atlas cerebral de Paxinos & Watson42. Los tejidos se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis neuroquímico 1H MRS. En Sajja et al., 20123 se proporciona información detallada sobre la visibilidad neuroquímica en los espectros 1H MRS después de la explosión.

Se pesaron muestras de tejido intacto congeladas (2–3 mg) y luego se colocaron en un rotor de circonio Bruker (2,9 mm de diámetro, 10 μL de capacidad) que contenía 2,5 μL de tampón PO4 (pH = 7,4), formiato, NaN3, 3-(trimetilsilil)-propiónico. ácido (TSP) y 2,5 μL de D2O. TSP sirvió como referencia de cambio químico interno (0,00 ppm), formato (8,44 ppm) para la fase automática y D2O para fijar la frecuencia central. Una vez preparado, el rotor se colocó rápidamente en un espectrómetro Bruker 11.7T Avance de 500 MHz mantenido a 4 °C y se hizo girar alrededor de su eje a 4,2 kHz; la orientación espacial del rotor era de 54,7° (el ángulo mágico) con respecto al campo magnético longitudinal (o principal) (Bo). Las faltas de homogeneidad del campo se ajustaron mediante un procedimiento de calce semiautomático (Bruker). Los espectros de tejido se adquirieron con una secuencia de pulsos sincronizada con el rotor CPMG43.

Cada espectro se analizó utilizando el software LCModel utilizando una combinación lineal de un conjunto personalizado de 27 espectros de modelos neuroquímicos (conjunto básico) para ajustarse a los neuroquímicos visibles por RM conocidos y calcular los valores de concentración absoluta para cada neuroquímico. La bondad de ajuste para cada compuesto se determinó requiriendo límites de Cramer-Rao <15% para análisis posteriores44,45. Las concentraciones absolutas de metabolitos visibles por RM se corrigieron según el peso del tejido y se expresaron como nmol/mg de peso del tejido.

Los animales (N = 6/grupo) fueron anestesiados con isoflurano (3%), perfundidos transcardialmente con paraformaldehído al 4% y luego los cerebros extraídos se fijaron en una solución de sacarosa al 30% antes de seccionarlos. Los cerebros fijos se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) y luego se congelaron en CO2 sólido. Las regiones de interés (Amy, Hipp, Nac y PFC se prepararon con un micrótomo a -20 °C. Para Hipp, se evaluaron los subcampos CA1, CA2, CA3 y el giro dentado. Amy no estaba subregional y se informó como la amígdala completa.

La inmunohistoquímica se realizó en secciones de regiones de interés para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; un indicador de activación celular específica de astrocitos), la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada 1 (Iba-1; marcador microglial), caspasa-3 escindida (apoptosis), neuronas tinción de núcleos (Neu-N; marcador neuronal), α-sinucleína (α-syn) y tinción de proteína tau para patología asociada con deterioro de la memoria.

Como se describió anteriormente36, las secciones de tejido procesadas se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en Triton X-100 al 0,5 % + tampón de bloqueo de gelatina al 0,5 % durante una hora. Después de lavarlos con PBS, los sitios de unión no específicos se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario anti-GFAP (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-Iba-1 (Biocare Medical, Concord, CA), anti-caspasa-3 escindida (Invitrogen, Carlsbad, CA)), anti- Neu-N (Millipore, Billerica, MA), anti-α-syn (Abcam, Cambridge, MA), anti-tau-5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante la noche a 4 °C. Después de un lavado con PBS, las muestras se incubaron durante una hora y media con anticuerpos IgG anti-rata secundarios marcados con fluoresceína (FITC) (1:250; Vector Laboratories, Burlingame, CA) o harina Alexa-555 anti-IgG. anticuerpo IgG de conejo (1:250; Cell Signaling, Danvers, MA) para las respectivas dianas de anticuerpos. Después de un lavado con PBS, las muestras se montaron en portaobjetos, se secaron al aire y se cubrieron con reactivo de oro prolongado antidesvanecimiento con 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secciones se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss con un aumento de 20X bajo filtros fluorescentes apropiados18. La intensidad de fluorescencia de las imágenes digitales adquiridas se cuantificó mediante el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Se incubaron rodajas de cerebro en NaOH al 1% y etanol al 80%, se hidrataron en etanol al 70% y se lavaron en agua destilada. Posteriormente, las secciones se incubaron a temperatura ambiente en permanganato de potasio al 0,006 % (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) en una etapa giratoria, se enjuagaron en agua destilada y se incubaron en una solución de FJB al 0,0004 % (Histochem Inc., Jefferson, AR). . Todas las soluciones se prepararon en dH2O. Luego, las secciones de cerebro se enjuagaron con agua destilada, se secaron al aire y se colocaron en un calentador de portaobjetos hasta que se secaron por completo. Los portaobjetos secos se aclararon en xileno y se montaron con 1,3-dietil-fenilxantina (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Un observador ciego a las condiciones experimentales llevó a cabo el recuento de células. Los recuentos se basaron en la morfología, la intensidad de la fluorescencia, el tamaño y la ubicación de neuronas específicas utilizando un microscopio de epifluorescencia Zeiss18. El número de intensidad de fluorescencia FJB + de las imágenes digitales adquiridas se cuantificó mediante el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Los efectos de la exposición a la explosión se midieron en experimentos separados (es decir, uno y tres meses después de la exposición a la sobrepresión de la explosión). Los estudios de inmunohistoquímica se trataron como dos experimentos separados para evitar influencias desconocidas y se evaluaron mediante análisis de varianza de dos colas (ANOVA), considerándose significativo p < 0,05. Se utilizó un ANOVA medido repetidamente de dos factores con la prueba post-hoc de Bonferroni para las pruebas de comportamiento, con p <0,05 considerado estadísticamente significativo. La significancia se evaluó utilizando el software estadístico SPSS™ y p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM).

Cómo citar este artículo: Sajja, VSSS et al. Déficits duraderos en la memoria y patología neuronal después de una lesión cerebral traumática inducida por una explosión. Ciencia. Rep. 5, 15075; doi: 10.1038/srep15075 (2015).

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Venkata Siva Sai Sujith Sajja, W. Brad Hubbard, Christina S. Hall y Pamela J. VandeVord

Departamento de Anestesiología, Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, MI

Farhad Ghoddoussi y Matthew P. Galloway

Departamento de Psiquiatría, Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, MI

Mateo P. Galloway

Salem VA Medical Center, Servicio de Investigación y Desarrollo, Salem, VA, EE. UU.

Pamela J. VandeVord

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VSSS, WBH y PJV contribuyeron a la redacción del manuscrito. VSS, WBH y CSH realizaron experimentos y análisis de comportamiento. VSSS, MPG y FG realizaron experimentos MRS. VSSS y PJV realizaron experimentos y análisis de inmunohistoquímica. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Sajja, V., Hubbard, W., Hall, C. et al. Déficits duraderos en la memoria y patología neuronal después de una lesión cerebral traumática inducida por una explosión. Representante científico 5, 15075 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15075

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Recibido: 01 de mayo de 2015

Aceptado: 15 de septiembre de 2015

Publicado: 05 de noviembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15075

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