Evaluación comparativa de p5+14 con SAP y péptido p5 por dual

Scientific Reports volumen 6, número de artículo: 22695 (2016) Citar este artículo

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La amiloidosis es un trastorno del plegamiento incorrecto de proteínas caracterizado por el depósito extracelular de amiloide, una matriz compleja compuesta de fibrillas de proteínas, glucosaminoglicanos hipersulfatados y componente P amiloide sérico (SAP). La acumulación de amiloide en los órganos viscerales da como resultado la destrucción de la arquitectura tisular, lo que conduce a la disfunción y falla del órgano. El diagnóstico diferencial temprano y el seguimiento de la enfermedad son fundamentales para mejorar los resultados de los pacientes; por lo tanto, las imágenes de amiloide de todo el cuerpo serían beneficiosas a este respecto. En Europa se realizan imágenes moleculares no invasivas del amiloide sistémico utilizando SAP marcado con yodo-123; sin embargo, este rastreador no está disponible en EE. UU. Por lo tanto, evaluamos péptidos polibásicos sintéticos, denominados p5 y p5+14, como radiotrazadores alternativos para detectar amiloidosis sistémica. En este documento, realizamos una evaluación comparativa de la efectividad del péptido p5+14 radiomarcado con p5 y SAP, en ratones cargados de amiloide, utilizando imágenes SPECT de energía dual y mediciones de biodistribución tisular. Los tres radiotrazadores se unieron selectivamente a amiloide in vivo; sin embargo, p5+14 fue significativamente más eficaz en comparación con p5 en ciertos órganos. Además, SAP se unía principalmente al amiloide hepatoesplénico, mientras que p5+14 se distribuía ampliamente en numerosos sitios anatómicos cargados de amiloide, incluidos el bazo, el hígado, el páncreas, los intestinos y el corazón. Estos datos respaldan la validación clínica de p5+14 como radiotrazador de amiloide para pacientes en los EE. UU.

Los depósitos de amiloide están compuestos de fibrillas de proteínas, en asociación con glicosaminoglicanos hipersulfatados y proteínas séricas como el componente P amiloide sérico (SAP)1. La incesante deposición de amiloide extracelular provoca la alteración de la arquitectura tisular2,3, citotoxicidad4 y, finalmente, disfunción y fallo orgánico. La amiloidosis sistémica es una enfermedad huérfana, con aproximadamente 3500 nuevos diagnósticos anualmente en los EE. UU. En estos pacientes, el amiloide puede afectar cualquier tejido visceral, pero la afectación cardíaca y renal se asocia con las tasas más altas de mortalidad1. Debido a su rareza y a la presentación clínica heterogénea, el diagnóstico temprano y preciso de las enfermedades amiloides sistémicas sigue siendo un desafío5. Las opiniones de expertos tanto de médicos como de investigadores sugieren que el diagnóstico temprano es fundamental para mejorar los resultados de los pacientes6,7. Actualmente, el diagnóstico de amiloidosis se basa en el examen de muestras de tejido obtenidas de biopsias teñidas con rojo Congo. La presencia de amiloide produce una birrefringencia verde cuando se observa microscópicamente con iluminación de polarización cruzada8,9. Esta técnica está anticuada, pero sigue siendo el estándar de diagnóstico. Sin embargo, el procedimiento de tinción y la interpretación no son triviales y las biopsias son propensas a errores de muestreo, todo lo cual puede conducir a resultados falsos negativos. Además, un diagnóstico positivo basado en la congofilia tisular no informa el alcance de la carga de amiloide en todo el cuerpo en los pacientes y la adquisición de biopsias de múltiples órganos no es práctica y puede contribuir a la morbilidad.

Obtener una representación completa de la carga de amiloide en los pacientes puede confirmar el diagnóstico, informar el pronóstico y ayudar en el seguimiento de la enfermedad. En la actualidad, el estándar de oro para las imágenes de amiloide sistémica, que se utiliza habitualmente sólo en Europa, implica la gammagrafía gamma utilizando SAP marcado con yodo-123 como radiotrazador10,11,12. Aunque eficaz, esta técnica no está aprobada por la FDA para su uso en Estados Unidos; por lo tanto, es necesario un método de imagen alternativo. Además, no ha demostrado ser eficaz para la detección clínica de amiloide en el corazón13,14, un órgano que está afectado en más del 50% de los pacientes con amiloidosis asociada a cadenas ligeras (AL), la forma más común de enfermedad amiloide visceral. . Con este fin, hemos desarrollado péptidos polibásicos sintéticos, reactivos con amiloide, que se unen preferentemente al amiloide a través de interacciones electrostáticas4. Estos péptidos se han utilizado para atacar y teñir específicamente depósitos de AL humano y de amiloide asociado a transtiretina (ATTR) en secciones de tejido fijadas con formalina in vitro15,16. Además, la reactividad del péptido con amiloide asociado a la inflamación (AA) en un modelo de ratón transgénico se ha documentado mediante el uso de imágenes por tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y microautorradiografía4,16,17,18. En particular, se han caracterizado bien dos péptidos α-helicoidales con una repetición de heptada Lys-Ala-Gln-Lys-Ala-Gln-Ala, denominados p5 y p5+144,15,16,17,18,19,20 ( Figura 1). De estos, el péptido p5+14 tiene una mayor afinidad por el amiloide, debido al aumento de la electropositividad y se ha mostrado excepcionalmente prometedor como agente de formación de imágenes de amiloide18. Están en marcha planes para evaluar este reactivo en un ensayo clínico de imágenes de fase I en pacientes con amiloidosis AL.

Características físicas de los péptidos reactivos a amiloide p5 y p5+14 y la proteína SAP.

(A) La estructura primaria de los péptidos p5 y p5+14 muestra la repetición heptada característica. Las propiedades físicas de las 3 proteínas se calcularon utilizando el software Protparam (//web.expasy.org/protparam/). Las estructuras secundarias de los péptidos se predijeron utilizando el programa de predicción en línea I-TASSER40. Se ha determinado la estructura cristalina de rayos X de SAP, PDB# 1SAC. Cromatogramas de purificación por HPLC (B) y espectros de espectrometría de masas (C) de los péptidos p5 y p5+14. Las masas para los péptidos p5 y p5+14 representan [M + 3H]+3 y [M + 5H]+5, respectivamente.

En este documento, presentamos una serie de estudios de efectividad comparativa que contrastan el péptido p5+14 con p5 y el estándar clínico, SAP, en ratones individuales con amiloidosis AA mediante el uso de imágenes SPECT de energía dual y mediciones cuantitativas de biodistribución tisular con corrección de derrame20. Hemos demostrado, in vitro, que el péptido p5+14 se une más ávidamente a las fibrillas de amiloide AL humanas, en comparación con p5 y también exhibió una captación significativamente mayor en ciertos órganos viscerales de ratones AA. Además, en comparación con SAP, que se observó principalmente en el hígado y el bazo, p5+14 se localizó en numerosos sitios anatómicos cargados de amiloide AA, en particular el páncreas y el corazón de ratones enfermos.

Ambos péptidos se purificaron como una sola especie mediante HPLC de fase inversa y tenían masas apropiadas, con protones adicionales [M + 3H]+3 y [M + 5H]+5, según lo determinado por el tiempo de desorción/ionización por láser asistida por matriz. espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF) (Fig. 1). Los péptidos y SAP se radiomarcaron fácilmente con >90 % de radiopureza después de la purificación cromatográfica, como lo demuestra SDS-PAGE y fosforimagen. Inicialmente, comparamos la reactividad de los péptidos p5 y p5+14 por su capacidad para unirse a amiloide in vitro e in vivo. Nuestra hipótesis fue que el aumento de la carga neta de p5+14 (Fig. 1) conferiría una mayor reactividad amiloide debido al aumento de las interacciones electrostáticas. Los ensayos de unión con péptidos marcados con 125I añadidos a fibrillas sintéticas de rVλ6Wil e IAPP, así como con extracto de amiloide ALκ4 humano y homogeneizado de hígado de AA murino, revelaron, en todos los casos, un aumento estadísticamente significativo en la unión de 125I-p5+14 en comparación con 125I. -p5 (p <0,05 utilizando una prueba t no apareada; Tabla 1). La unión de p5+14 al homogeneizado de hígado cargado de AA murino (p = 0,002) y rVλ6Wil (p = 0,02) fue ~15% mayor; sin embargo, la unión de ALκ4 aumentó en un 40% (p = 0,0006) y hubo un aumento del doble en la reactividad con las fibrillas IAPP (p = 0,001). Para evaluar la avidez electrostática relativa de cada péptido para las fibrillas de rVλ6Wil, se realizaron ensayos de unión en un entorno de fuerza iónica creciente (Fig. 2A). La concentración de NaCl requerida para disminuir la unión en un 50 % (IC50) fue de 0,5 M para 125I-p5, pero aumentó a ~1,2 M para el péptido 125I-p5+14, lo que indica que los 4 residuos de lisina adicionales habían conferido una avidez electrostática mejorada para las fibrillas ( Figura 2A).

Comparación de la reactividad amiloide del péptido p5 y p5+14 in vitro e in vivo.

(A) Unión de 125I-p5 (círculos grises) y 125I-p5+14 (círculos negros) a fibrillas rVλ6Wil, mediante ensayo de unión de péptidos, en soluciones de fuerza iónica creciente (media ± DE; DE fue <10 % para todos los puntos y las barras de error no son visibles). Los datos se ajustaron con una ecuación sigmoidea usando Prism. (B) Biodistribución tisular de energía dual de 125I-p5+14 y 99mTc-p5 en ratones AA. Las barras representan el %ID/g medio (n = 3) con DE. Se muestran puntos de datos individuales para cada ratón. Los datos se analizaron mediante una prueba t independiente con un valor α corregido por Bonferroni de 0,01, donde *p < 0,01.

Se realizaron mediciones de biodistribución tisular de energía dual para comparar la reactividad de 125I-p5 y 99mTc-p5+14 en ratones cargados de AA individuales (Fig. 2B). La retención de 99mTc-p5+14 fue significativamente mayor (p <0,01) en el hígado y los intestinos cargados de amiloide en comparación con el péptido 125I-p5 y fue comparable en todos los demás órganos evaluados (Fig. 2B).

A continuación, comparamos el péptido p5+14 con el agente de imágenes clínicas estándar, SAP, mediante el uso de imágenes SPECT de energía dual. Se indujo a ratones transgénicos H2/IL-6 a desarrollar amiloidosis AA sistémica grave mediante inyección de una suspensión de amiloide AA esplénico murino extraído. La presencia de amiloide en los ratones se confirmó mediante el examen de secciones de tejido utilizando el tinte amiloidófilo rojo Congo (Fig. 3). Se demostró que cada uno de los cinco ratones amiloides AA tenía enfermedad amiloide.

Distribución sistémica del amiloide AA en ratones H2/IL-6.

(A) Las secciones de tejido, teñidas con H&E o rojo Congo, de un ratón representativo indican la presencia de amiloide sistémico grave en ratones AA, como lo demuestra la birrefringencia azul-dorada, indicativa de amiloide, observada en las secciones teñidas de rojo Congo. (B) Cada uno de los cinco ratones AA tenía amiloide AA grave, como lo demuestra la presencia de depósitos birrefringentes de rojo Congo en un tejido representativo (bazo). Aumento del objetivo original 10×.

Las imágenes SPECT/CT de 125I-SAP y 9mTc-p5+14 en ratones AA revelaron diferencias específicas de órganos en la captación de amiloide de los dos radiotrazadores (el sujeto representativo se muestra en la Fig. 4A). En representaciones 3D de los datos de la imagen, se observó 99mTc-p5+14 distribuido de manera relativamente uniforme en todos los órganos viscerales. Esto contrasta con la unión de 125I-SAP, que se manifiesta principalmente como captación hepatoesplénica (Fig. 4A). Las representaciones bidimensionales de la imagen SPECT/CT confirmaron la captación visual de 99mTc-p5+14 en el hígado (L), el bazo (Sp), el páncreas (P) y los intestinos (Int) y la captación casi exclusiva de 125I-SAP por el amiloide. en el hígado y el bazo (Fig. 4A). En estos experimentos, no hubo evidencia visual de captación de ninguno de los radiotrazadores en el corazón, que se sabe que tiene sólo depósitos escasos y difusos de amiloide en este modelo.

Imágenes SPECT/CT de energía dual de 125I-SAP y 99mTc-p5+14 en ratones WT y cargados de amiloide AA representativos.

Imágenes coronales tridimensionales y bidimensionales de la distribución de 99mTc-p5+14 y 125I-SAP en ratones individuales con amiloidosis AA (A) y un control WT sano (B). La radiactividad tiene un color falso rojo-azul (imágenes 3D) y rojo o azul para 99mTc-p5+14 y 125I-SAP, respectivamente, en las imágenes 2D. Donde: L, hígado; P, páncreas; Sp, bazo; Int, intestinos; K, riñón; Tu, tiroides. Se tomaron imágenes de dos ratones, elegidos al azar, de cada conjunto de cinco ratones AA y cinco ratones WT.

En animales WT libres de amiloide (Fig. 4B), se observó radioactividad en los riñones (K) de ratones inyectados con 99mTc-p5+14 debido a la acumulación de 99mTc en la corteza renal asociada con el catabolismo del péptido. Por el contrario, se observó yodo radiactivo en la tiroides (Thy) de ratones que recibieron 125I-SAP (Fig. 4B). Esto se debió a la liberación de yoduro radiactivo durante la deshalogenación y el catabolismo de la SAP en el hígado y a la organificación del yoduro liberado por la tiroides. En particular, no hubo captación específica de ninguno de los radiotrazadores en órganos libres de amiloide.

La comparación cuantitativa de la absorción de 125I-SAP y 99mTc-p5+14 en órganos cargados de amiloide se logró mediante el uso de mediciones de biodistribución tisular de energía dual corregida por derrame (Fig. 5 y Tabla 2). Como lo predijeron los datos de imágenes SPECT, 99mTc-p5+14 y 125I-SAP se acumularon en órganos que contenían depósitos de amiloide: hígado, páncreas, bazo e intestinos (Fig. 5A; ratones individuales representativos). Sin embargo, no se observó retención en órganos libres de amiloide en ratones WT (Fig. 5B).

Datos de biodistribución de energía dual para 125I-SAP y 99mTc-p5+14 en dos ratones cargados de amiloide AA y un animal WT representativo.

Biodistribución del radiotrazador a las 24 h (SAP; barras grises) y 4 h (p5+14; barras negras) después de la inyección, en dos ratones hembra representativos con amiloidosis AA a las 5 semanas después de AEF (A) y los valores medios ± SD de cinco Animales WT (B). Los datos se expresan como %ID/g corregido cruzadamente. Arriba. En t. y Bajo. En t. Representa los intestinos superior e inferior, respectivamente. (C) Análisis estadístico de datos de biodistribución tisular. Las barras representan la media (n = 5) con DE. Se muestran puntos de datos individuales para cada ratón (símbolos abiertos = p5+14; símbolos rellenos = SAP). Los datos del hígado, el bazo, el intestino y el corazón se analizaron mediante una prueba t independiente y el páncreas con una prueba U de Mann Whitney. La significación se estableció utilizando el valor α corregido de Bonferroni de 0,01, donde *p < 0,01, **p < 0,001.

La absorción de 125I-SAP fue ~4 veces mayor en el bazo en comparación con 99mTc-p5+14 en cada ratón estudiado (p <0,001). Por el contrario, el amiloide retuvo cantidades significativamente mayores de 99mTc-p5+14 en el páncreas (p = 0,009) y el corazón (p < 0,001), en comparación con el 125I-SAP. En particular, la absorción de 125I-SAP por el amiloide AA pancreático fue notablemente baja (<1 % ID/g), mientras que la absorción media de 99mTc-p5+14 en este órgano fue del 7,6 % ID/g (n = 5 ratones). La unión de 99mTc-p5+14 en el corazón fue significativamente mayor que la de 125I-SAP (p < 0,001); sin embargo, el amiloide AA cardíaco es difícil de detectar en las imágenes SPECT debido a la naturaleza difusa y escasa de los depósitos en este órgano. Con la excepción del hígado, no se demostró ninguna correlación directa entre la captación de SAP y p5+14 mediante el análisis de correlación de Pearson en los órganos evaluados, lo que sugiere que los dos radiotrazadores pueden unirse a ligandos asociados a amiloide independientes (Tabla 2).

Actualmente no existen métodos en los EE. UU. para obtener imágenes de la carga de amiloide en todo el cuerpo en pacientes con amiloidosis sistémica. Aunque ciertos agentes de búsqueda ósea y trazadores de imágenes de amiloide Aβ se han mostrado prometedores en la detección de la enfermedad amiloide cardíaca, su uso es limitado y no hay evidencia de que sean capaces de detectar amiloide en todos los sitios anatómicos21,22,23,24. Dada la heterogeneidad de la afectación orgánica en pacientes con amiloidosis sistémica, sigue siendo necesario desarrollar agentes capaces de obtener imágenes de amiloide en múltiples sitios anatómicos, preferiblemente con reactividad panamiloide. En Europa, el amiloide sistémico se visualiza eficazmente mediante gammagrafía planar y SPECT utilizando SAP derivado de plasma humano radiomarcado con 123I10,11,12. Este reactivo no está aprobado para su uso por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., posiblemente debido a sus requisitos de procedimientos antivirales estrictos para moléculas biológicas de origen humano, que inactivan la actividad amiloidofílica de SAP. Por lo tanto, hemos desarrollado una serie de péptidos sintéticos polibásicos que se unen a la heparina con alta afinidad y especificidad por los glicosaminoglicanos hipersulfatados que se encuentran de manera ubicua en los depósitos de amiloide4,16,25,26,27. Además, estos péptidos también interactúan directamente con las fibrillas de amiloide independientemente de la proteína constituyente a partir de la cual se forman15,18. El objetivo de este estudio fue comparar directamente la actividad de unión a amiloide de los péptidos p5 y p5+14, así como de p5+14 con el estándar clínico actual, SAP.

El péptido p5 se identificó en una selección de siete péptidos reactivos a la heparina sintéticos y naturales como un péptido reactivo amiloide específico, como lo demuestra la SPECT/CT de ratones amiloides AA, estudios de biodistribución y microautorradiografía16. La interacción con el amiloide está impulsada principalmente por interacciones electrostáticas; sin embargo, p5 no se une a los abundantes proteoglicanos de sulfato de heparán expresados en la superficie celular y en las matrices extracelulares de los tejidos sanos16. Con base en estas observaciones iniciales, planteamos la hipótesis de que los péptidos con mayor propensión a la helicidad α y con mayor carga positiva podrían mejorar las interacciones péptido-amiloide observadas, que se consideran dependientes de la estructura secundaria del péptido y de las interacciones electrostáticas28.

Con esto en mente, el péptido p5+14 se construyó como una variante extendida de p5 con cuatro residuos de lisina adicionales. Este péptido se desarrolló como un agente mejorado dirigido al amiloide para su uso como trazador de imágenes moleculares en pacientes con amiloidosis sistémica18. Se ha demostrado que el péptido p5+14 se une a numerosas fibrillas de amiloide sintéticas (AL, Aβ y AIAPP), así como a extractos de amiloide humano ALκ y ALλ in vitro18. Además, cuando se radiomarcaba, p5+14 se unía preferentemente al amiloide AA en un modelo de ratón murino y no se acumulaba en tejidos sanos libres de amiloide18. La traducción del péptido p5+14 como agente de obtención de imágenes clínicas para pacientes con AL y amiloidosis sistémica asociada a transtiretina cuenta actualmente con el apoyo del Programa Science Moving towArds Research Translation and Therapy (SMARTT) del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de Estados Unidos. NIH.

Los datos presentados en este documento indican que el péptido p5+14 tiene una reactividad significativamente mejorada, en comparación con p5, con amiloide AA in vivo así como con fibrillas y extractos de amiloide AL y AIAPP in vitro. El aumento de la carga electropositiva dio como resultado una unión más ávida a las fibrillas sintéticas, como lo demuestra la estabilidad de la interacción péptido-fibrilla en un entorno de fuerza iónica creciente (Fig. 2A). La mayor reactividad amiloide debido al aumento de la carga probablemente contribuya a una mayor absorción y retención de este péptido por el amiloide in vivo. Sin embargo, la carga neta positiva por sí sola es insuficiente para explicar la reactividad específica de estos péptidos con amiloide porque péptidos igualmente altamente cargados, como la protamina, no exhiben una especificidad equivalente in vivo16. Rullo et al. demostraron que los péptidos α-helicoidales con residuos de lisina alineados en una matriz en una cara de la hélice se unían a la heparina de manera más efectiva que los péptidos igualmente cargados con espaciado no lineal de residuos de lisina28. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el aumento del contenido de lisina con una repetición de heptada estricta, en el contexto de una estructura secundaria de hélice α, haría que p5+14 fuera un agente de unión a amiloide más eficaz en comparación con el péptido p5.

El SAP radioyodado es el radiotrazador “estándar de oro” utilizado en Europa para la gammagrafía gamma de amiloide en pacientes. Para validar la eficacia de nuestro agente de imágenes 99mTc-p5+14 en comparación con 125I-SAP, examinamos su reactividad amiloide mediante imágenes SPECT de energía dual, que es una técnica poderosa para la evaluación comparativa de dos radiotrazadores en animales individuales. Esto se logra resolviendo los radionucleidos de baja y alta energía en los datos de SPECT. Las imágenes SPECT de energía dual evitan la variabilidad de la deposición de amiloide en ratones individuales, ya que tanto 125I-SAP como 99mTc-p5+14 se inyectaron y evaluaron en el mismo sujeto. La absorción de 125I-SAP en los ratones fue principalmente hepatoesplénica con una retención significativamente mayor en el bazo y el hígado, en relación con 99mTc-p5+14. El sitio de unión molecular de SAP al amiloide sigue siendo enigmático, aunque se ha demostrado in vitro que se une tanto a heparina29 como a fibrillas sintéticas30, de manera similar al perfil de unión del péptido p5+14. Es poco probable que SAP pueda competir con p5+14 por los sitios de unión de amiloide en nuestros experimentos de imágenes, ya que solo se inyectaron cantidades de microgramos de cada radiotrazador y la carga de amiloide es extensa (estimamos ~10-20% de la masa del bazo). sobre tinción histológica de secciones de tejido). En este modelo de ratón, los perfiles de absorción de órganos sugieren que SAP y p5+14 se unen a diferentes sitios en los depósitos de amiloide (Fig. 4). Una explicación para esta observación es que, en el bazo, el ligando reactivo a SAP es abundante y está ampliamente disponible para unirse; no ocurre lo mismo con el sitio de unión de amiloide p5+14. Alternativamente, las barreras farmacocinéticas u otras barreras físicas, que SAP no encuentra, pueden dificultar la accesibilidad y la absorción de p5+14 en los depósitos de amiloide esplénicos. Aunque el mecanismo preciso subyacente a esta disparidad sigue siendo enigmático, la existencia de sitios de unión discretos para SAP y p5+14 también está respaldada por el hallazgo de que el amiloide AA pancreático, en estos ratones, se unía preferentemente a p5+14, pero se observó poco o ningún SAP. en este órgano. Este hallazgo es consistente con estudios de imágenes previos con SAP en este modelo de ratón20,31. Es interesante especular que, incluso dentro de un sujeto individual con amiloidosis sistémica, existen “fenotipos” de amiloide específicos de tejido que pueden estar relacionados con el patrón de sulfatación de los glucosaminoglicanos codepositados en el amiloide o diferencias en la morfología de las fibrillas32. . Independientemente, los datos de imagen y biodistribución indican que 99mTc-p5+14 define con mayor precisión la distribución orgánica de los depósitos de amiloide en los ratones AA en comparación con 125I-SAP.

Anteriormente hemos demostrado la captación específica de péptidos sintéticos, p5 y p5+14, en todos los depósitos de amiloide de ratones AA mediante microautorradiografía16,18. En el presente estudio, 99mTc-p5+14 se comparó directamente con p5 y mostró una afinidad superior por el amiloide. En comparación con SAP, el péptido p5+14 radiomarcado proporcionó imágenes más mejoradas de los depósitos de amiloide en numerosos sitios anatómicos (Fig. 4). Por lo tanto, el péptido p5+14 tiene el potencial de proporcionar imágenes efectivas de todo el cuerpo de la carga de amiloide sistémica que es comparable y quizás superior en ciertos tejidos a la proporcionada por SAP.

Los ratones transgénicos H2-Ld-huIL-6 Balb/c (H2/IL-6) expresan constitutivamente el transgén IL-6 humano, lo que provoca una inflamación crónica y grave y la sobreproducción de reactivos de fase aguda, como la proteína amiloide A sérica, el precursor. proteína de la amiloidosis sistémica asociada a inflamación (AA)31,33. La deposición de amiloide se indujo en ratones hembra de 8 semanas de edad mediante inyección intravenosa de 100 μg de factor potenciador de amiloide (AEF, una preparación insoluble de fibrillas de amiloide aisladas del bazo de ratones con amiloidosis AA) suspendido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril34 . Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Tennessee. La Universidad de Tennessee es una institución acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC-I).

La SAP humana se aisló de tejidos cargados de amiloide derivados de autopsias, como se describió anteriormente20. Brevemente, se suspendió el bazo humano cargado de amiloide a ~100 mg/ml utilizando un homogeneizador Polytron (Brinkmann Instruments, Westbury, Nueva York) en la configuración 6, durante 10 segundos en solución salina tamponada con tris (TBS)/CaCl2 2 mM. Luego, el material insoluble se sedimentó mediante centrifugación a 10.000 x g durante 30 minutos y se lavó nuevamente mediante centrifugación. Luego, la muestra se homogeneizó nuevamente en presencia de TBS/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 10 mM. Después de una centrifugación final como se indicó anteriormente, se añadió CaCl2 al sobrenadante, que contenía SAP humano crudo para lograr una concentración final de 20 mM y se incubó durante 2 horas con 5 ml de perlas de Sefarosa conjugada con O-fosforil-etanolamina (PE) (preparadas por mezclando 113 mg de PE con 50 ml de ECH-Sepharose activada [GE Healthcare] a pH 4,5 durante la noche) a temperatura ambiente. Luego, las perlas se lavaron 2 veces con 100 ml de TBS/CaCl2 2 mM y el SAP humano se eluyó mediante la adición de TBS/EDTA 10 mM. Las fracciones que contenían SAP se combinaron y se dializaron frente a 10 volúmenes de PBS. Se demostró que el producto tenía >95 % de pureza mediante el examen de perfiles de gel SDS-PAGE teñidos con Coomassie.

Se radioyodó SAP purificado (~100 μg) mediante la adición de 2 mCi de 125I (PerkinElmer, Waltham, MA) en presencia de 10 μg de cloramina T, durante 2 min35. La reacción se detuvo añadiendo 20 µg de metabisulfito de sodio. El radioisótopo no unido se separó del producto mediante cromatografía de filtración en gel sobre resina Ultragel Aca-34, usando PBS/gelatina al 0,1% como fase móvil. Se recogieron fracciones de aproximadamente 0,5 ml y se midió la radiactividad en cada una mediante conteo gamma; se combinaron las tres fracciones con los recuentos más altos.

Los péptidos p5 y p5+14 se sintetizaron comercialmente (Keck Laboratories, New Haven, CT) y se purificaron, internamente, mediante HPLC de fase inversa usando una fase móvil de acetonitrilo (ACN), ácido trifluoroacético al 0,05% con un caudal de 1 ml/ seg (aumento del 2%/min en ACN). Las muestras de péptido p5 y p5+14 aisladas del análisis de HPLC se secaron y resuspendieron en disolvente analito (30 % de ACN, 0,01 % de TFA en agua) a ~0,2 mg/ml en preparación para el análisis (+)MALDI-TOF. Se suspendió ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) en un disolvente de matriz (50 % de ACN, 0,3 % de TFA en agua) a una concentración final de 8 mg/ml. Se mezclaron cuatro µL de suspensión de analito (péptido) y 24 µL de solución de matriz y se vertió 1 µL de la mezcla en la placa MALDI. La espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, Boston, MA, EE. UU.). Normalmente, los espectros espectrométricos de masas se obtuvieron en modo lineal con una potencia de láser de 2390 kW.cm-2. Todos los espectros MALDI se calibraron externamente con estándares peptídicos conocidos.

Los péptidos se marcaron radioactivamente con 125I esencialmente como se describe anteriormente, pero se purificaron mediante filtración en gel usando una matriz de exclusión de tamaño Sephadex G-25 (PD10; GE Healthcare)16,20. La conjugación de péptidos con 99mTc se logró de la siguiente manera. A 20 µL de NaOH 0,15 N se le añadieron 20 µL (~40 µg) de péptido solubilizado en agua y 10 µL de SnCl2 100 µg/mL recién preparado en HCl 0,01 N seguido de 2 mCi de 99mTc04- en ~100 µL de solución salina ( Cardinal Health, Knoxville, Tennessee). Después de un tiempo de reacción de 15 minutos a temperatura ambiente, el producto se purificó usando una columna PD10 como se describió anteriormente36. La pureza radioquímica de todos los productos se determinó cualitativamente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS analizada mediante imágenes de fósforo (Cyclone Storage Phosphor System, PerkinElmer, Shelton, CT).

Se realizaron experimentos comparativos de absorción de energía dual en ratones AA individuales (5 semanas después de la inducción de amiloide con AEF) y ratones de tipo salvaje (n = 5 por grupo). Todas las imágenes de SPECT/CT se realizaron utilizando una plataforma SPECT/PET/CT trimodal Inveon37 (Siemens preclinical, Knoxville, TN). Los datos de las imágenes se adquirieron y reconstruyeron utilizando Inveon Acquisition Workplace (IAW) ver. 2.0.

Para la comparación de 125I-SAP y 99mTc-p5+14, a los ratones se les administró 125I-SAP (45 μCi, 8 μg) y 20 h después recibieron 99mTc-p5+14 (110 μCi, 5 μg). Los ratones fueron sacrificados 4 h después de la inyección de 99mTc-p5+14. Los datos de las imágenes de los radionucleidos de baja y alta energía se obtuvieron secuencialmente adquiriendo 60 proyecciones de 16 segundos en un total de 1,5 revoluciones. Se utilizó un colimador de cinco orificios (cuerpo entero del ratón) con una apertura de 1 mm de diámetro y a 30 mm del centro del campo de visión. Los datos de la imagen en la ventana de energía apropiada se reconstruyeron utilizando un algoritmo Máximo A Priori (MAP - 16 iteraciones, 6 subconjuntos, β = 1) en una matriz con dimensiones xey de 88 y dimensión z de 312 y vóxeles isotrópicos de 0,5 mm. . Luego se aplicó una corrección de atenuación post hoc a los datos reconstruidos utilizando datos de imágenes de TC. La corrección de dispersión se realizó utilizando un método SPECT de triple ventana de energía (TEW)38.

Para todos los ratones, se adquirieron datos de TC para el registro conjunto anatómico y la corrección de atenuación, utilizando un voltaje de rayos X polarizado a 80 kVp con una corriente de ánodo de 500 μA. Se utilizaron dos posiciones de cama con una exposición de 240 ms y se recopilaron 361 proyecciones que cubrían 360° de rotación continua con baja ampliación y agrupamiento a 4. Los datos se reconstruyeron utilizando una implementación del algoritmo de haz cónico filtrado por Feldkamp39 en una matriz de 256 × 256 × 603. con vóxeles isotrópicos de 211,4 μm.

Para la evaluación histológica de la presencia de amiloide en cada ratón, se cortaron secciones de 6 μm de espesor de bloques incluidos en parafina y fijados con formalina que contenían tejidos de ratones que habían recibido SAP y p5+14 radiomarcados. Las secciones de tejido se colocaron en portaobjetos de microscopio Plus y se contratiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). La detección de amiloide se logró en secciones de tejido consecutivas mediante tinción con una solución alcalina de rojo Congo (0,8 % p/v de rojo Congo, 0,2 % p/v de KOH, 80 % de etanol) durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una contratinción con hematoxilina de Mayer para 2 minutos.

Todas las muestras se examinaron utilizando un microscopio óptico Leica DM500 equipado con filtros de polarización cruzada (para rojo Congo). Las imágenes microscópicas digitales se adquirieron utilizando una cámara CCD enfriada (SPOT RT-Slider; Diagnostic Instruments).

Para comparar los péptidos p5+14 y p5, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa en la vena lateral de la cola una mezcla de 125I-p5+14 (150 μCi, ~3 μg) y 99mTc-p5 (300 μCi, ~8 μg) y los ratones fueron sacrificados mediante una sobredosis de anestésico isoflurano 1 h después de la inyección. Los tejidos se recolectaron en la necropsia para medir la biodistribución. También se recolectaron órganos de ratones a los que se les inyectó 125I-SAP y 99mTc-p5+14 después de la obtención de imágenes SPECT/CT. Se colocó un pequeño volumen de tejido de cada ratón en un vial de plástico tarado y se pesó. La radioactividad en las ventanas de baja y alta energía (125I y 99mTc, respectivamente) se midió utilizando un contador gamma Wizard 3 automatizado (1480 Wallac Gamma Counter, Perkin Elmer) con una corrección cruzada del canal de alta a baja energía del 4,6%, aplicada a mano. Los datos de biodistribución se expresaron como porcentaje de dosis inyectada por gramo (%ID/g) de tejido.

Unión de p5 y p5+14 marcados con 125I a fibrillas de amiloide sintéticas compuestas de proteínas de dominio variable λ6 recombinantes derivadas de Wil del paciente (rVλ6Wil) y polipéptido amiloide de islotes humanos, así como extractos de amiloide asociado a cadena ligera humana (AL) y homogeneizados de hígado de AA murinos. , se realizaron como se describió anteriormente15,18. Brevemente, se centrifugaron 25 µl de sustrato de 1 mg/ml en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml a 21.000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 200 μl de PBS con 0,05% de tween-20 (PBST). Se añadieron a la suspensión diez microlitros de una dilución 1:100 de péptido marcado con 125I (~100.000 cuentas por minuto (CPM); ~5 ng de péptido). La mezcla se hizo girar a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, las muestras se centrifugaron dos veces a 15.000 x g durante 10 minutos. Los sobrenadantes y los sedimentos se separaron después de cada paso y la radioactividad en cada uno se midió usando un contador gamma Cobra II (Perkin Elmer) con una adquisición de 1 minuto. Los ensayos de unión se realizaron en PBS o soluciones de fuerza iónica creciente (NaCl 0,15–2 M) y el porcentaje de péptido marcado con 125I unido al sustrato granulado se determinó utilizando la “ecuación (1)”:

Se utilizaron estadísticas de asimetría y curtosis para evaluar el supuesto estadístico de normalidad para comparaciones y correlaciones entre sujetos. Cualquier estadística de asimetría o curtosis por encima de un valor absoluto de 2,0 asumió una distribución no normal. El supuesto de homogeneidad de la varianza se probó con la Prueba de igualdad de varianzas de Levene. Se utilizaron pruebas t de muestras independientes para comparar p5+14 y la retención de SAP en órganos cargados de amiloide (hígado, bazo, páncreas, intestinos y corazón). Para los análisis se informaron medias y desviaciones estándar. Si se violaba un supuesto estadístico, se utilizaba una prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Para las estadísticas no paramétricas se informaron las medianas y los rangos intercuartílicos (RIC). Se realizaron correlaciones de Pearson para comparar los datos de biodistribución tisular (%ID/g) en todos los órganos. Para ajustar las comparaciones múltiples, se utilizó un valor alfa corregido de Bonferroni de 0,01 (valor alfa de 0,05/5 pruebas = 0,01) para determinar la significación estadística y todos los análisis se realizaron con SPSS versión 21 (IBM Corp., Armonk, NY).

Cómo citar este artículo: Martin, EB et al. Evaluación comparativa de p5+14 con SAP y péptido p5 mediante imágenes SPECT de energía dual de ratones con amiloidosis AA. Ciencia. Rep. 6, 22695; doi: 10.1038/srep22695 (2016).

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Nos gustaría agradecer a Jim Wesley y Craig Wooliver por su ayuda con el procesamiento de tejidos, la preparación de muestras y la tinción con rojo Congo. También agradecemos a Helen P. McWilliams-Koeppen por corregir el manuscrito. También agradecemos la asistencia del Dr. Shawn Campagna, Héctor Castro González y Xinyi Lu para los análisis espectrométricos de masas. Este trabajo fue apoyado por la subvención PHS R01DK079984 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales NIDDK, así como fondos del Programa de Investigación Traslacional e Imágenes Moleculares y el Departamento de Medicina de la UTMCK.

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Tennessee, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, EE. UU.

Emily B. Martin, Angela Williams, Tina Richey, Stephen J. Kennel y Jonathan S. Wall

Departamento de Radiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Tennessee, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, EE. UU.

Alan Stuckey, Stephen J. Kennel y Jonathan S. Wall

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina de la Universidad de Tennessee, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, EE. UU.

Eric Heidel

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JSW y SJK diseñaron los experimentos; JSW, EBM, REH y SJK analizaron los datos, prepararon las cifras y escribieron el artículo; AW, TR, AS y SJK realizaron los experimentos.

JSW y SJK son inventores de una patente estadounidense (n.º 8.808 666) que describe el uso de los péptidos p5 y p5+14 como agentes de formación de imágenes para la amiloidosis. JSW, SJK, TR, EBM y AS son propietarios iguales de Solex LLC, que otorgó sublicencias sobre derechos de propiedad intelectual de la Universidad de Tennessee.

Este trabajo está bajo una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; Si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

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Martín, E., Williams, A., Richey, T. et al. Evaluación comparativa de p5+14 con SAP y péptido p5 mediante imágenes SPECT de energía dual de ratones con amiloidosis AA. Representante científico 6, 22695 (2016). https://doi.org/10.1038/srep22695

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Recibido: 23 de septiembre de 2015

Aceptado: 22 de febrero de 2016

Publicado: 03 de marzo de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22695

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