La estructura cristalina de la neumolisina con una resolución de 2,0 Å revela el empaquetamiento molecular del pre

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 13293 (2015) Citar este artículo

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La neumolisina es una citolisina dependiente del colesterol (CDC) y un factor de virulencia de Streptococcus pneumoniae. Mata las células formando poros ensamblados a partir de anillos oligoméricos en membranas que contienen colesterol. Cryo-EM ha revelado las estructuras de los oligómeros de preporo y de poro insertado unidos a la superficie de la membrana; sin embargo, los contactos moleculares que median en estos oligómeros se desconocen porque no se dispone de información de alta resolución. Aquí hemos determinado la estructura cristalina de la neumolisina de longitud completa con una resolución de 1,98 Å. En la estructura, los contactos cristalinos demuestran las probables interacciones que permiten la polimerización en la membrana celular y el empaquetamiento molecular del complejo preporo. La actividad hemolítica se anula en mutantes que interrumpen estos contactos intermoleculares, destacando su importancia durante la formación de poros. Una estructura cristalina adicional del dominio de unión a la membrana por sí sola sugiere que los cambios en la conformación de un bucle rico en triptófano en la base de la toxina promueven interacciones monómero-monómero tras la unión a la membrana mediante la creación de nuevos contactos. En particular, los residuos en la interfaz se conservan en otros miembros de la familia CDC, lo que sugiere un mecanismo común para el ensamblaje de poros y preporos.

La citolisina dependiente del colesterol (CDC), la neumolisina1, es un factor de virulencia del patógeno humano Streptococcus pneumoniae (neumococo)2, la principal causa de neumonía bacteriana y un agente importante de meningitis y septicemia, así como de enfermedades debilitantes como la otitis media, la artritis, queratitis y sinusitis3. Se encuentra en prácticamente todos los aislados de neumococo y desempeña un papel clave en la colonización, invasión e inflamación bacteriana4,5,6. Una característica central de la toxina es la formación de poros transmembrana en las membranas que contienen colesterol7, que lisan o alteran el funcionamiento celular, dependiendo de la concentración8,9,10. La neumolisina y otras CDC se unen a las membranas de los mamíferos a través de un bucle rico en triptófano y un par treonina-leucina dentro de un dominio de unión a la membrana en la base de la toxina11,12. Se ha propuesto que el bucle rico en triptófano surge del cuerpo de la toxina al asociarse con la membrana12. Los tres triptófanos están implicados en la unión a la membrana, pero Trp433 y Trp435 son particularmente importantes13,14. Una vez unidos a la membrana, los monómeros se oligomerizan para formar un complejo previo al poro que posteriormente sufre un conjunto complejo de transiciones estructurales para formar un poro transmembrana, que generalmente comprende de 30 a 50 subunidades. Las estructuras de los oligómeros del preporo y del poro insertado se han determinado mediante crio-EM a ~28 Å y estas estructuras, junto con un análisis reciente de la CDC relacionada, suilisina, muestran que la formación de poros sigue al colapso vertical del preporo. estructura con dos horquillas beta extendidas que penetran la membrana para formar el gran poro del barril beta7,15.

Aunque se han determinado estructuras de rayos X de alta resolución para varios CDC, la neumolisina ha demostrado ser difícil de alcanzar. En consecuencia, el análisis estructura-función se ha basado en modelos basados en las estructuras de las otras toxinas CDC. Fundamentalmente, la falta de datos de alta resolución significa que se desconocen las interacciones que permiten que los monómeros de neumolisina se empaqueten para formar los complejos de poros y preporos. En este trabajo hemos determinado la estructura de la neumolisina a una resolución de 1,98 Å. La disposición del empaquetamiento uno al lado del otro en el cristal demuestra el empaquetamiento de monómeros en el complejo preporoso. Datos estructurales y de mutagénesis adicionales han identificado residuos que probablemente contribuyan a la oligomerización durante la formación previa de los poros.

Se produjeron neumolisina de longitud completa y una forma truncada que comprende el dominio de unión a membrana (dominio 4) mediante expresión en E. coli y se purificaron mediante cromatografía de afinidad y filtración en gel. Los cristales de la toxina de longitud completa se cultivaron a 4 °C y a pH 8,5. Los mejores cristales se obtuvieron a partir de proteínas que contenían sustituciones Asp385Asn y Cys432Ala. Ninguna mutación impide la formación de poros16,17. La unidad asimétrica contenía una sola molécula que tenía la estructura característica de cuatro dominios de un CDC, con tres dominios no contiguos (dominios 1 a 3) unidos al dominio de unión a membrana C-terminal (Fig. 1A) a través del dominio en forma de correa. 2. Los cristales del dominio de unión a la membrana se cultivaron a temperatura ambiente y contenían dos moléculas en la unidad asimétrica. Ambos modelos refinados tienen una buena estereoquímica (Tabla 1) con 95% y 93% de residuos dentro de las regiones favorecidas de Ramachandran.

Estructura del dominio de la neumolisina y los probables cambios tras la unión a la membrana.

(A) Los dominios 1, 2 y 3 son contiguos y están conectados al dominio de unión a membrana C-terminal (dominio 4) a través del dominio 2. (B) superposición de los dominios de unión a membrana de la neumolisina de longitud completa (PLY), Estructuras de dominio 4 de neumolisina (PLY D4) y perfringolisina O (PFO; PDB: 1PFO12;). Las estructuras revelan los cambios probables que ocurren al unirse a la membrana. En particular, el bucle rico en triptófano se gira hacia afuera y hacia abajo (flecha) exponiendo a Trp433, para permitir la unión a la membrana.

El bucle rico en triptófano se proyecta desde la base del dominio 4 en la estructura de la neumolisina de longitud completa, lo que refleja la probable conformación de unión a la membrana (Fig. 1B). En particular, dos de los residuos de triptófano, Trp433 y Trp435, que anteriormente demostraron ser importantes para la unión a la membrana y la lisis celular13, se proyectan hacia afuera, por lo que están en posición de permitir interacciones con una bicapa lipídica. Por el contrario, el bucle está parcialmente plegado hacia atrás en la estructura del dominio 4 solo (Fig. 1B) y completamente doblado hacia atrás contra el cuerpo del dominio 4 en la estructura previamente determinada de perfringolisina O12. En conjunto, las estructuras son consistentes con la sugerencia previa de que el bucle salta hacia afuera y hacia abajo cuando la toxina se une a la membrana de una célula de mamífero (Fig. 1B)12.

En la estructura de la neumolisina de longitud completa, el dominio 4 está desplazado ~ 30 ° con respecto al plano del eje largo de los dominios 1 a 3, de modo que la toxina se asemeja a una varilla doblada desde un lado (Fig. 2A). La posición relativa del dominio 4 difiere en las estructuras disponibles de los CDC. Por ejemplo, está desplazado ~15 Å y gira ~25° en la estructura cristalina de perfrigolisina O (PDB: 1PFO12;), mientras que está desplazado aún más (~40°) en intermedilisina (18; Fig. 2A). ). Estas diferencias sugieren flexibilidad en la unión del dominio 2-dominio 4 que permitiría que la toxina se acople a la superficie de la membrana y se empaquete para formar el complejo pre-poro.

El empaquetamiento de monómeros en el cristal de neumolisina revela el empaquetamiento del complejo preporoso.

(A) Las estructuras cristalinas de neumolisina (PLY), intermedilisina (ILY) y perfringolisina (PFO) revelan diferencias en el ángulo entre los dominios 1 a 3 y el dominio 4. (B) superposición de dos modelos ajustados en la densidad del preporo crioEM (superficie gris ; PDB: 2BK27) con monómeros adyacentes de la estructura cristalina (cian y verde). La desviación rms fue de 4,90 Å (más de 849 átomos de Cα).

Una característica sorprendente de los cristales de neumolisina es que los monómeros se empaquetan uno al lado del otro en la red cristalina, asemejándose al empaquetamiento molecular del complejo preporoso. La superposición de dos moléculas de neumolisina de la estructura cristalina con monómeros adyacentes de la estructura crio-EM (PDB: 2BK27) produce una desviación RMS de 4,90 Å (más de 849 átomos de Cα; Fig. 2B). En particular, el dominio 4 está en la posición correcta para la unión a la membrana en relación con el resto de la toxina (Fig. 2B). La interfaz entre las moléculas de neumolisina se crea mediante la cara cóncava de un monómero empaquetada contra la cara convexa de su vecino. Aunque abarca casi todo el eje longitudinal de la toxina, solo interactúa un subconjunto relativamente pequeño de residuos (Fig. 3A). En particular, esto no se pudo predecir a partir de las estructuras crioEM porque la resolución es demasiado baja para ver las cadenas laterales. Los cuatro dominios realizan contactos intermoleculares, pero en su mayoría involucran los dominios 1 y 4. Existe cierta complementariedad de carga entre las caras convexa y cóncava, siendo la primera más cargada negativamente y la segunda más positiva (Fig. 3A). La interfaz incluye 44 residuos de la cara cóncava y 41 residuos de la cara convexa, con una superficie total enterrada de 939,6 Å2 y 962,8 Å2, respectivamente. Aunque la mayoría de los residuos en la interfaz son polares, hay relativamente pocas interacciones intermoleculares polares: puentes salinos entre Asp8 y Arg226 y Glu434 y Arg399 y enlaces de hidrógeno entre la cadena lateral de Asn339 y el grupo carbonilo de Pro87 y entre el grupo hidroxilo. de Tyr461 y los grupos amina y carbonilo de His407. Por lo tanto, es probable que la principal contribución a la oligomerización de los monómeros en la membrana sea la complementariedad de la superficie, lo que lleva a la exclusión de agua. En particular, de los 85 residuos enterrados, 41 son idénticos y 63 están conservados en al menos tres de los otros CDC para los cuales hay estructuras disponibles, lo que sugiere que es probable que la interfaz esté relativamente bien conservada en otros CDC (Fig. 3B). . Esta conclusión se ve respaldada por la comparación de la estructura de la neumolisina con las estructuras cristalinas de la intermedilisina19 y la listeriolisina O20, que también se empaquetan una al lado de la otra en el cristal. Sorprendentemente, los contactos en las tres estructuras involucran regiones equivalentes de los polipéptidos CDC y muchos de los residuos que interactúan están conservados (Fig. 3B).

La interfaz conservada entre monómeros de neumolisina adyacentes.

(A) Las superficies de interacción convexas y (B) cóncavas que muestran el potencial electrostático. Las regiones enterradas por la interacción están sombreadas en amarillo y morado y los residuos clave están etiquetados. (Panel inferior) Alineación de la secuencia de neumolisina con otros CDC. Los residuos que forman las interfaces en las estructuras cristalinas de neumolisina (PLY), intermedilisina (ILY) y listeriolisina (LLO) están sombreados como en las partes (A y B) anteriores. Los residuos que se conservan en perfringolisina O (PFO), antrolisina O (ALO) y suilisina (SLO) están sombreados en consecuencia. Los residuos similares están en verde.

Para comprobar si los contactos intermoleculares observados en el cristal son importantes para la actividad de la toxina, se introdujeron mutaciones en los residuos y se midió la actividad citolítica resultante mediante un ensayo hemolítico simple. En total, se realizaron 18 mutaciones individuales en residuos expuestos a la superficie. Las mutaciones Arg399Ala y Glu434Ala se diseñaron para interrumpir el puente salino entre los dominios de unión a membrana adyacentes y Tyr461Phe y Tyr461Ala para evitar el enlace de hidrógeno entre Tyr461 y la cadena principal de His407. Además, se introdujeron mutaciones para alterar el empaquetamiento hidrofóbico eliminando las cadenas laterales que se empaquetan contra el monómero adyacente o introduciendo grandes grupos cargados (Glu o Arg) en la interfaz. Leu11Arg, Ser68Glu, Asn86Arg, Thr88Glu, Arg147Ala, Asp205Arg Arg226Ala Thr304Arg, Asp338Ala, Ser68Glu, Asn86Arg, Arg147Glu, Asp338Arg fueron diseñados para alterar la interfaz en la parte superior de la toxina (dominios 1 a 3) y Arg437Ala. interrumpir el dominio 4/dominio 4 interfaz. Aunque en su mayoría son de naturaleza polar, estos residuos no forman contactos polares intermoleculares, sino que excluyen el agua en la interfaz. También se crearon tres mutantes dobles con mutaciones en el dominio 4: Arg339Ala + Glu434Ala; Glu434Ala + Tyr461Ala; y Glu434Ala + Arg437Ala. Es importante destacar que, con la excepción de Arg147, que se encuentra en el límite de los dominios 1/3 y Thr304 dentro del dominio 3, la mutagénesis se limitó a residuos en los dominios 1 y 4 que experimentan cambios posicionales relativamente pequeños tras la formación de poros. Las regiones que experimentan grandes cambios conformacionales, incluidos los residuos 155–186 y 253–285 que forman las horquillas β que atraviesan la membrana y el dominio 2, que gira para permitir que las horquillas penetren en la membrana, se excluyeron para garantizar que las mutaciones no impidieran los poros. formación misma. Todos los mutantes se produjeron y purificaron como para la neumolisina de tipo salvaje. Al igual que con la proteína de tipo salvaje, eluyeron de una columna de filtración en gel como picos únicos, correspondientes a monómeros y dicroísmo circular y espectroscopia de fluorescencia (Fig. 4B) confirmaron que estaban plegados.

Actividades hemolíticas y propiedades biofísicas de neumolisinas mutantes.

(A) hemólisis de eritrocitos de oveja por mutantes de neumolisina seleccionados. (B) Espectros de fluorescencia de neumolisina plegada y desplegada (en guanidina-HCl 2 M) y neumolisina con liposomas. Los espectros de fluorescencia de todos los mutantes fueron comparables a los del tipo salvaje y mostraron cambios similares con respecto a la intensidad de fluorescencia y λem, máx. (C,D), desnaturalización de neumolisinas mutantes y de tipo salvaje medida por cambios en la intensidad de fluorescencia (C) y λem, máx (D). La transición de despliegue medida por el cambio en λem, max correspondió aproximadamente a la disminución de la fluorescencia observada en (C). (E) inhibición de la hemólisis mediada por colesterol por neumolisinas mutantes y de tipo salvaje. Los datos son el promedio de seis mediciones.

Casi todas las mutaciones redujeron la capacidad de la neumolisina para lisar los glóbulos rojos de oveja, pero en diferentes grados (Figs. 4A y 5A y Tabla 2). Los efectos más sorprendentes se observaron para las mutaciones únicas Asn339Arg y Asp205Arg, que no lograron lisar los eritrocitos de oveja en las concentraciones más altas probadas (10 μM), lo que refleja una disminución de la actividad hemolítica >3000 veces (Tabla 2). Ambos residuos están ubicados hacia el medio de la interfaz de unión dentro del dominio 1 (Fig. 5A). Otras mutaciones en el dominio 1 también provocan grandes disminuciones de la actividad, incluidas Thr88Glu, Arg147E y Arg226Ala y, en menor medida, Ser68Glu y Asn86Arg. La mutación Thr304Arg dentro del dominio 3 también resultó en una gran disminución en la actividad (300 veces). En la estructura, la cadena lateral de treonina forma parte de una cadena β que se empaqueta contra la porción de hidrocarburo de la cadena lateral de Lys268. Esta hebra puede desplazarse tras la oligomerización en la membrana para permitir que los monómeros se empaqueten para formar el anillo. Sólo tres mutaciones tuvieron un efecto relativamente pequeño sobre la hemólisis (≤2 veces): Leu11Arg, Asp338Ala y V341Arg. Curiosamente, los tres residuos están ubicados en la región posterior del dominio 1, que forma la parte exterior del anillo preporo, hacia el perímetro de la interfaz de unión. La agrupación de estos residuos sugiere que esta región de la toxina puede ser menos importante para la oligomerización, quizás reflejando cierta flexibilidad.

Contribuciones de los residuos a la actividad hemolítica reveladas por mutagénesis dirigida al sitio.

(A) Caras convexas (L) y cóncavas (R) de neumolisina que muestran las posiciones de las mutaciones y los cambios relativos en la actividad hemolítica. (B) Empaquetado entre dominios de unión a membrana adyacentes en la supuesta conformación de unión a membrana de neumolisina (estructura de neumolisina de longitud completa). Glu434 forma un puente salino con Arg399 de la molécula adyacente y también orienta a Arg437 para que forme parte de la interfaz monómero-monómero. (C) La sustitución con la estructura del dominio 4 (naranja) revela que la red polar se pierde cuando el bucle rico en triptófano se retrae total o parcialmente como se predice que ocurrirá en solución. De esta manera, la unión a la membrana promovería la oligomerización de los monómeros de neumolisina en la superficie celular.

Las mutaciones dentro del dominio 4 también redujeron la actividad hemolítica de la neumolisina. El reemplazo de Tyr461 con un residuo de alanina condujo a una disminución de cinco veces en la actividad, mientras que la mutación Tyr461Phe tuvo poco efecto, lo que sugiere que la exclusión de agua en la interfaz del monómero es más importante que los enlaces de hidrógeno con His407. La interrupción de la pequeña red polar que involucra Glu434 y Arg437 de un monómero y Gln402 y R399 del monómero adyacente (mediante mutaciones Arg437Ala, Glu434Ala o Arg399Ala) redujo la actividad hemolítica de 6 a 10 veces. En la estructura cristalina, Glu434 no solo forma un puente salino con Arg399 sino que también interactúa con Arg437, que a su vez forma parte de la interfaz de unión al empaquetarse contra el monómero adyacente. Curiosamente, estas interacciones sólo son posibles cuando el bucle rico en triptófano se invierte hacia afuera en la supuesta conformación de unión a la membrana. Cuando el bucle se pliega hacia atrás, como en la estructura del dominio 4 o en la estructura de perfringolisina O (Fig. 1B), Glu434 ya no hace contacto con Arg399 o Arg437 (Fig. 5B). Este mecanismo ayudaría a estabilizar la oligomerización en la superficie de la membrana pero no en solución. Como era de esperar, el doble mutante Glu434Ala + Arg437Ala está aún más alterado que las mutaciones simples (pérdida de actividad 30 veces mayor). Las otras mutaciones dobles se ven afectadas de manera similar con disminuciones de actividad de 20 a 30 veces (Tabla 1).

Para confirmar que las mutaciones no afectaron la actividad hemolítica mediante desestabilización o cambios en la unión a la membrana, comparamos las estabilidades y las propiedades de unión a la membrana de cinco de los mutantes con las mayores disminuciones en la actividad hemolítica: Asn339Arg, Asp205Arg, Glu434Ala, Arg147Glu y el mutante doble. Glu434Ala + Tyr461Ala. Las estabilidades se examinaron mediante desnaturalización de guanidina-HCl y se midieron mediante fluorescencia. La neumolisina tiene un perfil de desnaturalización complejo, lo que probablemente refleja su estructura multidominio en la que la intensidad de la fluorescencia aumentó en el rango de 0,75 a 1,25 M de guanidina-HCl y luego disminuyó de 1,25 a 1,75 M. Aumentos adicionales en la concentración de desnaturalizante no produjeron más cambios. lo que sugiere que la neumolisina ya estaba completamente desplegada (Fig. 4C). La disminución en la intensidad de la fluorescencia estuvo acompañada por un cambio en λem, máx. de 347 nm a 354 nm, consistente con residuos de triptófano enterrados que quedaron expuestos al solvente polar. Al trazar λem, max frente a la concentración de guanidina-HCl se obtuvo una transición simple de dos estados en la que el punto medio era ~1,4 M de guanidina-HCl (Fig. 4D). Todos los cinco mutantes tenían curvas de desnaturalización comparables tanto con respecto a la intensidad de fluorescencia (Fig. 4C) como a λem, máx (Fig. 4D), lo que indica que las mutaciones no los desestabilizan.

Para investigar la unión a la membrana, agregamos neumolisina a liposomas que contienen colesterol usando fluorescencia para detectar cualquier cambio que ocurra. La unión de liposomas por la toxina de tipo salvaje condujo a un pequeño aumento (~15%) en la intensidad de la fluorescencia que fue acompañado por una disminución en λem, máx. de 347 a 342 nm (Fig. 4B), presumiblemente reflejando la concentración rica en triptófano. El bucle queda enterrado en la bicapa lipídica hidrófoba. Todos los mutantes con actividades hemolíticas reducidas se probaron de esta manera y mostraron cambios de fluorescencia comparables a los de la toxina de tipo salvaje, tanto con respecto a la intensidad de fluorescencia como a λem, máx. Aunque no fue posible medir las afinidades de unión en este ensayo, estos datos indican que las toxinas mutantes se unen a las bicapas lipídicas que contienen colesterol de manera similar a la toxina de tipo salvaje. Para examinar más a fondo la unión de lípidos, se utilizó un ensayo de inhibición hemolítica para los 3 mutantes que mostraron cierta actividad hemolítica residual. En este ensayo, se incubó neumolisina con concentraciones crecientes de colesterol antes de la adición de eritrocitos de oveja. El colesterol inhibió la hemólisis por la neumolisina de tipo salvaje con una CI50 de 20 nM. Se midieron valores de CI50 de 9, 14 y 15 nM para los mutantes Glu434Ala, Arg147Glu y Glu434Ala + Tyr461Ala, respectivamente, lo que indica que se unen al colesterol con afinidades comparables a la toxina de tipo salvaje. En conjunto, estos datos muestran que la pérdida de actividad hemolítica no es causada por cambios en la estabilidad o la unión del colesterol. Por tanto, las mutaciones probablemente interrumpen el empaquetamiento intermolecular de los monómeros de neumolisina en la superficie de la membrana antes de la formación de poros.

Se ha demostrado que la neumolisina se oligomeriza espontáneamente en solución, pero sólo en altas concentraciones de proteínas, lo que revela interacciones débiles entre monómeros, incluso en ausencia de una bicapa lipídica que contenga colesterol21,22. Proponemos que estas interacciones han sido capturadas en los cristales de neumolisina y esta conclusión se ve reforzada por las estructuras de intermediolisina y listeriolisina O, que se empaquetan juntas de manera similar. La estructura revela complementariedad de forma y carga entre monómeros de neumolisina adyacentes en los que una superficie cóncava y con carga más negativa se empaqueta contra una cara convexa más positiva. La superficie enterrada es modesta en comparación con los complejos proteína-proteína estables23, como se esperaría de una proteína que es predominantemente monomérica en concentraciones fisiológicas. Sin embargo, al unirse a una bicapa lipídica, la difusión en sólo dos planos posibles favorecería la oligomerización para formar el preporo. Es probable que la autoasociación se vea favorecida aún más por interacciones adicionales que sólo ocurren una vez que los monómeros de neumolisina se han unido a la superficie de la membrana. Por lo tanto, la pequeña red polar que involucra a Glu434 y Arg437 de un monómero y Gln402 y Arg399 de su vecino solo es posible cuando el rico en triptófano se voltea hacia afuera en la supuesta conformación de unión a membrana (Fig. 5B). En solución, Glu434 no entra en contacto con Arg437, por lo que no puede contribuir al empaquetamiento monómero-monómero.

Los monómeros son paralelos en la estructura cristalina, pero deben estar ligeramente desplazados en la membrana celular para crear los oligómeros de poro y preporo en forma de anillo. Además, los poros varían en tamaño, típicamente con entre 30 y 50 subunidades, por lo que debe haber cierta tolerancia en el empaquetamiento intermolecular (que varía desde un desplazamiento de 12° en un 30mero hasta 7,2° en un 50mero). En particular, la mayoría de las interacciones de empaquetamiento en el cristal se encuentran dentro de la porción central de la interfaz de unión (en lugar de hacia los bordes, lo que tendería a bloquear la interacción) y, por lo tanto, es probable que permitan cierto margen de maniobra en el ángulo entre los monómeros.

La mayoría de los contactos entre monómeros de neumolisina se producen entre residuos de los dominios 1 y 4, en la parte superior e inferior de la toxina, respectivamente. Se cree que estos dominios son los que menos cambian de conformación durante la formación de los poros, con el dominio 4 sirviendo como un anclaje de membrana fijo en todo momento y el dominio 1 actuando como un puente entre el dominio 2, que gira a medida que el preporo colapsa para formar el poro y el dominio 3. , que se reorganiza para formar las horquillas β que penetran la membrana7. Por lo tanto, es probable que al menos algunos de los contactos intermoleculares que involucran a los dominios 1 y 4 se retengan dentro del estado de poro, estabilizando así los oligómeros durante y después del cambio conformacional principal.

Recientemente se ha descubierto que la neumolisina y varias otras CDC son lectinas que probablemente tienen receptores duales en las células huésped que involucran un ligando de carbohidratos además del colesterol24. La neumolisina se une al sialil-Lewis X en los glóbulos rojos. Significativamente, los supuestos residuos de unión a carbohidratos que se identificaron en este estudio no están involucrados ni enterrados por las interacciones intermoleculares identificadas en nuestro trabajo, lo que permite la unión simultánea al receptor y la formación previa de poros en la superficie de la membrana.

La neumolisina es un objetivo de los inhibidores para el tratamiento de la enfermedad neumocócica debido a su importancia para la patogenicidad neumocócica y su conservación en los diferentes serotipos de S. pneumoniae. La interrupción de la oligomerización de neumolisina es una estrategia potencial atractiva para el diseño futuro de tales inhibidores y la estructura descrita aquí forma la base para enfoques racionales.

El gen que codifica la neumolisina del serotipo D39 se amplificó mediante PCR y se clonó en el polienlazador de un vector de expresión basado en pET modificado. La proteína se sintetizó con una etiqueta His6 N-terminal. Se cultivaron E. coli BL21 (DE3) recién transformadas hasta una DO600 de 0,6 a 0,8, se indujeron con IPTG 0,1 mM y se incubaron a 18 °C, con agitación a 220 rpm durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3500 g durante 15 minutos a 4 °C y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM y Tween 20 al 1% v/v a pH 7,5) con un inhibidor de proteasa. tableta (Roche). Las células se lisaron mediante sonicación y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación. Luego se cargó el sobrenadante en una columna de níquel-Sefarosa (5 ml; GE Healthcare), previamente equilibrada con tampón de lisis. Después de la carga, la columna se lavó con 50 ml de tampón de lisis sin Tween 20 y la neumolisina se eluyó usando un gradiente lineal de imidazol entre 0 y 1 M. La neumolisina se purificó adicionalmente mediante filtración en gel usando una columna Superdex 200 16/60 en Tris 20 mM. -HCl a pH 7,5. El dominio 4 se expresó como una fusión de proteína de unión a maltosa y se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de amilosa-Sefarosa (1 ml; GE Healthcare). El dominio 4 se liberó mediante digestión durante la noche con proteasa TEV y se separó de la proteína de unión a maltosa mediante filtración en gel en una columna Superdex 200 16/60. Se introdujeron mutaciones en la neumolisina mediante PCR y las proteínas se expresaron y purificaron como para la toxina de tipo salvaje.

La neumolisina se cristalizó utilizando el método de difusión de vapor en gota sentada mezclando volúmenes iguales de neumolisina (10 mg/ml) y Tris-Bicina 100 mM, pH 8,5, que contenía CaCl2 30 mM, MgCl2 30 mM, 20 % v/v de glicerol, 14 %. p/v PEG 4K, cloruro de fosfocolina 6 mM a 4 °C. El dominio 4 se cristalizó en PEG 2000 MME al 30 % p/v que contenía tiocianato de potasio 100 mM a 20 °C. Todos los cristales se almacenaron en nitrógeno líquido y se mantuvieron a 100 K durante la recolección de datos. Los datos de difracción se recopilaron en Diamond Light Source y se procesaron con Mosflm25. Las fases de la proteína de longitud completa se determinaron mediante reemplazo molecular con Phaser26 utilizando la estructura de perfringolisina como modelo de búsqueda (PDB: 1M3I). Las fases para la estructura del dominio 4 se determinaron utilizando el dominio 4 de la estructura de neumolisina como modelo de búsqueda. Los modelos se optimizaron mediante el uso de ciclos de refinamiento manual con Coot27 y refinamiento en Refmac5, parte del paquete de software CCP428 y en Phenix29. Tanto la neumolisina de tipo salvaje como la neumolisina que contenía la doble sustitución Asp385Asn y Cys432Ala cristalizaron, pero el mutante dio consistentemente cristales de mejor calidad.

Se lavaron glóbulos rojos de oveja (1% v/v; Thermo Scientific) sedimentando 10 ml de sangre de oveja desfibrinada a 1734 g, a 4 °C y resuspendiendo el sedimento celular en solución salina tamponada con fosfato enfriada. Se hicieron alícuotas de diluciones en serie dobles de neumolisina en solución salina tamponada con fosfato en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo y se mezclaron con un volumen igual de sangre de oveja al 1% v/v. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se sedimentaron glóbulos rojos intactos y restos celulares mediante centrifugación a 1734 g, a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a los pocillos correspondientes en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano y se midió la absorbancia de cada pocillo a 410 nm. Los ensayos de inhibición se llevaron a cabo de manera similar excepto que se agregaron diluciones de colesterol a una cantidad fija de neumolisina (0,626 µM). Esta concentración de neumolisina fue suficiente para lisar los eritrocitos incluso en los mutantes con actividad hemolítica reducida.

Los datos de fluorescencia se recogieron en un instrumento Fluoromax-4 (Horiba Jobin Yvon) a una concentración final de proteína de neumolisina 1 μM, utilizando una cubeta de fluorescencia de cuarzo de bajo volumen (300 μl). Las proteínas se excitaron a 280 nm con un ancho de rendija de 2,5 nm y se detectó fluorescencia entre 300 y 400 nm a intervalos de 1 nm con un ancho de rendija de 2,5 nm. Todos los espectros se recogieron a 20 °C. Se permitió que las muestras se equilibraran durante 150 segundos antes de recolectar los espectros y restar los blancos de tampón de todos los conjuntos de datos.

Los liposomas se generaron mediante la adición de L-α-fosfatidilcolina (130 µmoles; 100 mg) a colesterol (130 µmoles; 50 mg) y fosfato de dihexadecil (13 µmoles; 7,1 mg) a 5 ml de una mezcla 1:1 de metanol/cloroformo en un matraz aforado de vidrio (5 ml). La mezcla se solubilizó mediante agitación y el líquido se eliminó bajo una corriente seca de nitrógeno sobre hielo. El nitrógeno se detuvo una vez que todo el líquido visible se había evaporado y los lípidos eran un gel amarillo translúcido que se pegaba a las paredes del matraz. Los lípidos se suspendieron en 5 ml de PBS mediante agitación vorticial y luego sonicación a temperatura ambiente durante 90 segundos.

Cómo citar este artículo: Marshall, JE et al. La estructura cristalina de la neumolisina con una resolución de 2,0 Å revela el empaquetamiento molecular del complejo preporo. Ciencia. Rep. 5, 13293; doi: 10.1038/srep13293 (2015).

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JEM, BHAF, ARG, RL, MdAS, MEM, PCEM, PWA y RW realizaron los experimentos y/o analizaron/interpretaron los datos. PCEM, PWA y RW idearon los experimentos. PWA y RW escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Marshall, J., Faraj, B., Gingras, A. et al. La estructura cristalina de la neumolisina con una resolución de 2,0 Å revela el empaquetamiento molecular del complejo preporo. Representante científico 5, 13293 (2015). https://doi.org/10.1038/srep13293

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Recibido: 30 de marzo de 2015

Aceptado: 16 de julio de 2015

Publicado: 03 de septiembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep13293

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